De un solo paso metabolómica: Hidratos de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos cuantificados en un procedimiento único
Summary
El método de la ureasa de preparación de muestras para análisis GC / MS de metabolitos intermedios es presentado por su inventor. El método permite un paso de seguimiento de cribado neonatal de errores congénitos por espectrometría de masas en tándem de los hidratos de carbono cuantificar, orgánicos y aminoácidos a todos en un solo proceso.
Abstract
Cada niño nacido en los EE.UU. es ahora seleccionados para un máximo de 42 trastornos genéticos raros llamados "errores congénitos del metabolismo". El método de detección se basa en la espectrometría de masas y cuantifica acilcarnitinas como una pantalla para acidemias orgánicas, así como las medidas de los aminoácidos. Todos los estados también realizan pruebas enzimáticas para los trastornos de los hidratos de carbono como la galactosemia. Debido a que los resultados pueden ser no específicos, pruebas de seguimiento de resultados positivos es necesario utilizar un método más definitivo. El presente informe describe la "ureasa" método de preparación de muestras para la detección de errores innatos. Enzima ureasa cristalina se utiliza para eliminar la urea de los fluidos del cuerpo que permite que la mayoría de los otros metabolitos solubles en agua para deshidratar y derivado de cromatografía de gases en un solo procedimiento. La deshidratación por evaporación en una corriente de nitrógeno se ve facilitada por la adición de acetonitrilo y cloruro de metileno. Entonces, trimethylsilylation lleva a cabo en la presencia de un catalizador único trifluoroacetato trietilamonio,. Inyección automatizada y es seguida por cromatografía de macro-impulsado cuantificación personalizadas de 192 metabolitos y semi-cuantificación de todos los componentes principales con las bibliotecas especializadas de espectros de masas de compuestos biológicos TMS derivado. El análisis se puede realizar en la plataforma Chemstation ampliamente utilizado con las macros y librerías disponibles por parte del autor. En nuestro laboratorio, más de 16.000 muestras de pacientes han sido analizados usando el método con un rendimiento diagnóstico del 17% – es decir, el 17% de los resultados de las muestras revelan los resultados que deben ser tramitadas por el médico solicitante. Se incluyen en estas más de 180 confirmados errores innatos, de los cuales aproximadamente el 38% no podría haber sido diagnosticado con los métodos anteriores.
Protocol
Discussion
El método de la ureasa (1) ha sido citado 62 veces en la literatura médica con varias modificaciones. Grupo de Matsumoto (2,3) simplificó el procedimiento para el alto rendimiento de cribado neonatal e informó de los resultados de 16.000 pacientes. Kuhara y otros (4-7) han reportado el uso del método en varios casos de diagnóstico de errores innatos y seguimiento. Rhead (8) también confirmó la utilidad del método para el diagnóstico clínico y el seguimiento de los errores innatos. El método ha sido aplicado a la orina de los osos, ratones knock-out, los elefantes y los homogeneizados de moscas de la fruta entera y sus larvas (9). Los medios de cultivo de Cryptococcus antes y después de la mutagénesis dirigida también se analizaron, sin el paso de ureasa (10). El método ha sido aplicado a la evaluación de la nutrición humana en estudiantes de medicina, pacientes con síndrome de Down y demencia veteranos ancianos después de la carga de los sujetos con dosis orales de los aminoácidos triptófano, metionina e isoleucina (11). Los ocho vitaminas B se evaluó mediante la cuantificación de los productos de descomposición de los tres aminoácidos que, entre ellos, requieren que todos los 8 vitaminas en algún momento de su degradación. Los efectos tóxicos de los fármacos y su mitigación mediante el suplemento vitamínico se ha reportado (12). Muestras de líquido amniótico de embarazos con síndrome de Down normal y se analizaron e informaron (13-15).
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La asistencia técnica capaz de Anthony Thomas se agradece.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MSD 5975 | Agilent | GC/MS/Computer | ||
| MSD 5973 | Agilent | GC/MS/Computer | ||
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 | |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes, Isotec, Cambridge Isotope Lab | |||
| Solvents | Fisher | |||
| Analytes | Sigma, Universidad Autonoma de Madrid, Ernesto Brunet | |||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | ||
| TEA/TFA | Fluka/Sigma | 09747 | ||
| Vials | Supelco/Sigma | Z115088/12EA | ||
| Merlin Microseal | Agilent | 5181-8815 | ||
| MSTFA | Thermal Scientific | 48913 |
Riferimenti
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