Een stap Metabolomica: Koolhydraten, organische-en aminozuren gekwantificeerd in een uniforme procedure
Summary
De urease de methode van monstervoorbereiding voor GC / MS analyse van intermediaire metabolieten wordt gepresenteerd door de uitvinder ervan. De methode maakt een stap-follow-up van de pasgeboren screening op aangeboren afwijkingen door tandem massaspectrometrie door het kwantificeren van koolhydraten, organische en aminozuren allemaal in een enkel proces.
Abstract
Elk kind geboren in de VS is inmiddels gescreend tot 42 zeldzame genetische aandoeningen genaamd "aangeboren stofwisselingsziekten". De screening methode is gebaseerd op tandem massaspectrometrie en kwantificeert acylcarnitines als een scherm voor organische acidemias en ook maatregelen aminozuren. Alle staten voeren ook enzymatische testen op koolhydraten aandoeningen zoals galactosemie. Omdat de resultaten kunnen niet-specifieke, follow-up testen van de positieve resultaten is nodig met behulp van een meer definitieve methode. Het voorliggende rapport beschrijft de "urease" methode van monstervoorbereiding voor aangeboren afwijking screening. Kristallijne urease enzym wordt gebruikt om ureum te verwijderen uit lichaamsvloeistoffen die het mogelijk maakt de meeste andere water oplosbare metabolieten te uitgedroogd en gederivatiseerd worden voor gaschromatografie in een enkele procedure. Onttrekken van water door verdamping in een stikstofstroom wordt vergemakkelijkt door het toevoegen van acetonitril en methyleenchloride. Dan, trimethylsilylation vindt plaats in de aanwezigheid van een unieke katalysator, triethylammonium trifluoracetaat. Geautomatiseerde injectie en chromatografie wordt gevolgd door macro-gedreven custom kwantificering van 192 metabolieten en semi-kwantificatie van elke belangrijke component met behulp van gespecialiseerde bibliotheken van massa spectra van TMS gederivatiseerd biologische verbindingen. De analyse kan worden uitgevoerd op de veelgebruikte Chemstation platform met behulp van de macro's en bibliotheken verkrijgbaar bij de auteur. In ons laboratorium hebben meer dan 16.000 patiënten monsters werden geanalyseerd met behulp van de methode met een diagnostische opbrengst van ongeveer 17% – dat wil zeggen 17% van de monsters resultaten blijkt bevindingen dat verder moet worden gehandeld door de aanvragende arts. Inbegrepen in deze zijn meer dan 180 bevestigd aangeboren fouten, waarvan ongeveer 38% niet hadden kunnen worden gediagnosticeerd met behulp van eerdere methoden.
Protocol
Discussion
De urease methode (1) werd 62 keer geciteerd in de medische literatuur met verschillende wijzigingen. Matsumoto groep (2,3) vereenvoudigde de procedure voor het high-throughput neonatale screening en de resultaten van 16.000 patiënten. Kuhara en anderen (4-7) hebben melding gemaakt van het gebruik van de methode in diverse gevallen van aangeboren afwijking diagnose en follow-up. Rhead (8) bevestigde ook de methode hulpprogramma voor de klinische diagnose en follow-up van de aangeboren fouten. De methode is toegepast op urine van beren, knock-out muizen, olifanten en homogenaten van hele vruchten vliegen en hun larven (9). Cultuur media van Cryptococcus voor en na plaats-gerichte mutagenese werden ook geanalyseerd, zonder dat de urease stap (10). De methode is toegepast op menselijke voeding beoordeling in medische studenten, het syndroom van Down patiënten en demente bejaarden veteranen na het laden van de patiënten met orale doses van de aminozuren tryptofaan, methionine en isoleucine (11). Alle acht B-vitaminen werden beoordeeld door het kwantificeren van de afbraakproducten van de drie aminozuren die, onder hen verlangen dat elke 8 vitaminen op een bepaald punt in hun degradatie. De toxische effecten van geneesmiddelen en hun mitigatie door vitamine suppletie is gemeld (12). Vruchtwater monsters van normaal en het syndroom van Down zwangerschappen werden geanalyseerd en gerapporteerd (13-15).
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De bekwame technische bijstand van Anthony Thomas is dankbaar erkend.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MSD 5975 | Agilent | GC/MS/Computer | ||
| MSD 5973 | Agilent | GC/MS/Computer | ||
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 | |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes, Isotec, Cambridge Isotope Lab | |||
| Solvents | Fisher | |||
| Analytes | Sigma, Universidad Autonoma de Madrid, Ernesto Brunet | |||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | ||
| TEA/TFA | Fluka/Sigma | 09747 | ||
| Vials | Supelco/Sigma | Z115088/12EA | ||
| Merlin Microseal | Agilent | 5181-8815 | ||
| MSTFA | Thermal Scientific | 48913 |
Riferimenti
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
