RNAi Chapeamento para C. elegans Alimentação: Uma Técnica para Induzir a Expressão de DSRNA Alvo em E. coli
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Kolundzic, E., et al. Aplicação de RNAi e Expressão do Fator de Transcrição induzida pelo calor para reprogramar células germinativas para neurônios em C. elegans. J. Vis. Exp. (2018).
Este vídeo descreve os princípios por trás do tratamento RNAi em C. elegans e demonstra um protocolo para derrubar lin-35 em uma cepa de verme transgênico.
Protocol
Este protocolo é extraído de Kolundzic, et al, Aplicação da RNAi e Expressão do Fator de Transcrição Induzida por Choque térmico para reprogramar células germinativas para neurônios em C. elegans, J. Vis. Exp. (2018). Preparação da solução Placas NGM-Agar (1 L) Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone…
Representative Results
Figura 1: Fenótipo Pvul causado pela RNAi contra lin-53. (Topo) Imagem dic de L4/jovens adultos estágio F1 progêneros derivados do controle ou lin-53 RNAi mães tratadas. Barras de escala = 20 μm. (Inferior) Animais tratados com lin-53 RNAi exibem o fenótipo de vulva saliente(pvul) (cabeças de flecha preta). O fenótipo pvul confirma que rnai contra lin-53</em…
Materials
| Chemicals | |||
| Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
| Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
| Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
| Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
| CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
| Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
| Gelatine | Roth | 4275.3 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| K2PO4 | Roth | T875.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
| MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
| NaCl | Roth | 9265.1 | |
| NaClO | Roth | 9062.3 | |
| NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
| Tris | Roth | AE15.2 | |
| Carbenicillin | Roth | 634412 | |
| Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
| Incubators | |||
| Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
| Microscopes | |||
| Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
| Bacterial strains | |||
| Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus). | ||
| Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
| Worm strains | |||
| BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. | derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
| RNAi Clones | |||
| lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
| empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 |
Citazione di questo articolo
RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20138, doi: (2023).