Placcatura RNAi per alimentazione C. elegans: una tecnica per indurre l'espressione di dsRNA bersaglio in E. coli
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Kolundzic, E., et al. Applicazione dell’espressione del fattore di trascrizione indotta da RNAi e heat-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in C. elegans. J. Vis. Exp. (2018).
Questo video descrive i principi alla base del trattamento RNAi in C. elegans e dimostra un protocollo per abbattere il lin-35 in un ceppo di vermi transgenici.
Protocol
Questo protocollo è tratto da Kolundzic, et al, Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018). Preparazione della soluzione Piastre NGM-Agar (1 L) Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone media (ad esempio Bacto-Pe…
Representative Results
Figura 1: Fenotipo Pvul causato da RNAi contro lin-53. (In alto) Immagine DIC dei vermi di progenie F1 di stadio L4/giovani adulti derivati dal controllo o dalle madri trattate con lin-53 RNAi. Barre di scala = 20 μm. (in basso) Gli animali trattati con lin-53 RNAi mostrano il fenotipo vulva sporgente (pvul) (teste di freccia nere). Il fenotipo pvul conferma che RNAi c…
Materials
| Chemicals | |||
| Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
| Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
| Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
| Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
| CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
| Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
| Gelatine | Roth | 4275.3 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| K2PO4 | Roth | T875.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
| MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
| NaCl | Roth | 9265.1 | |
| NaClO | Roth | 9062.3 | |
| NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
| Tris | Roth | AE15.2 | |
| Carbenicillin | Roth | 634412 | |
| Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
| Incubators | |||
| Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
| Microscopes | |||
| Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
| Bacterial strains | |||
| Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus). | ||
| Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
| Worm strains | |||
| BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. | derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
| RNAi Clones | |||
| lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
| empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 |
Citazione di questo articolo
RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20138, doi: (2023).