Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

Wachsen E. coli-Zellen in Luria-Beltrani Brühe (LB)-Medium zu exponentiellen Phase (OD = 0.2-0.4). Die Kultur in LB mit 50 pg / ml Cephalexin für 15 min auf filamentösen Wachstum zu induzieren ergänzt, und dann konzentrieren sich die Kultur durch 5-mal durch Zentrifugation. Machen PEI-beschichteten Deckglas durch fließendes 1% Polyethylenimin in Wasser in einer Flusskammer verdünnt und mit Wasser waschen nach einer 5-minütigen Inkubation. Flow die konzentrierte Zellkultur in die Kammer, und wusch mit einer Mischung aus LB und Cephalexin (50μg/mL) nach 3 min zu losen Zellen zu entfernen. Inkubieren der Kammer bei 37 ° C für 30 min-1 Stunde, damit die anhaftenden Zellen wachsen, bevor sie auf die optische Fallen Instrument. Machen Polylysin-beschichteten Kügelchen durch Inkubation 0,5-um-Durchmesser Polystyrolkügelchen (Bangs Labs) in 0,1% Polylysin in Wasser für 30 min verdünnt. Dann waschen Sie die Perlen 3-mal und resuspendieren in Wasser. Verdünnen Sie die Bead-Lösung um den Faktor zwei in LB mit Cephalexin (50μg/mL), und fügen Sie ihn in die Strömungskammer. Optisch Falle einer schwimmenden Kügelchen, und tippen Sie auf die freie Spitze einer Zelle. (Wir verwenden ein Mad City Labs Piezo-Bühne, um der Bewegung der Probe zu kontrollieren.) Wenn ein geeigneter Perlen / Zell Kombination gefunden wird, waschen Sie die Kammer mit Cephalexin in LB (50μg/mL) zu losen Perlen zu entfernen. Run individuell geschriebenen LabView Programm Biegekräfte zu Zelle und nehmen Kraft-Weg-Daten gelten. Programmdetails Kalibrieren Detektor-Response durch Rastern der beigefügten Perle innerhalb der Detektionslaserstrahl und Aufzeichnung 3D PSD Spannungssignale. Identifizieren Zelle langen Achse in mikroskopischen Bild. Bewegen Zelle in Schritten in eine Richtung senkrecht zu der Zelle Längsachse. Notieren Sie sich die Wegstrecke und die Verschiebung von der optischen Falle. Convert Verschiebung nach Krafteinwirkung mit der zuvor gemessenen Falle Steifigkeit und sparen Spitze Vertreibung und Gewalt in eine Datei. Secrets to Success: In Schritt 8), muss man eine Zelle mit einem gut definierten stecken Ende finden. Einige Zellen sind nur an einer Spitze, und die Biegekraft auf die andere Spitze stecken führt zu einer whole-cell schwenkbare anstatt Biegen. Ein geeignetes Paar ist durch Biegen jede Zelle schnell von Hand mit dem Joystick-gesteuerten Phase Bewegung gefunden. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1. Diese Abbildung zeigt Kraft-Weg-Daten für eine einzelne Zelle. Die Steigung dieser Geraden ist die Biegesteifigkeit der Zelle.