Dissezione del tubulo malpighiano da una mosca adulta: isolamento di un organo osmoregolatorio ed escretore
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Rossano, A. J. e Romero, M. F. Quantificazione ottica del pH intracellulare in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia con un indicatore di pH fluorescente geneticamente codificato. J. Vis. Exp. (2017).
Questo articolo descrive la dissezione dei tubuli malpighiani anteriori (MT) da una mosca Drosophila femmina e un protocollo di esempio di Rossano et al. (2017) in cui le MT sono preparate per l’imaging dal vivo in una camera di perfusione.
Protocol
Questo protocollo è un estratto da Rossano e Romero, Quantificazione ottica del pH intracellulare in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia con un indicatore di pH fluorescente geneticamente codificato, J. Vis. Exp. (2017). 1. Preparazione di diapositive in poli-L-lisina Disegnare un bordo di 40 x 20 mm con una penna PAP idrofobica intorno alla parte superiore dei vetrini standard da 75 x 25 mm e mettere da parte per asciugare per 15 minuti a RT. Utili…
Representative Results
Figura 1: Fabbricazione di aste di vetro per la movimentazione di tubuli malpighiani.A – E. Processo di riscaldamento e trazione di un’asta di vetro per produrre un cono e un angolo adatti alla movimentazione di MT. Le frecce denotano la direzione e l’entità della forza da applicare. F. Fotografia di uno strumento di vetro opportunamente fabbricato. Barra di scala = 10 <a href="https…
Materials
| Poly-L-Lysine (PLL) Solution | Sigma-Aldrich | P4832 | Store at 4 °C, can be reused. |
| Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm | Sigma-Aldrich | GBL622105 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Available from multiple vendors. |
| Helping Hands Soldering Stands | Harbor Freight Tools | 60501 | Available from multiple vendors. |
| Schneider's Medium | Fisher Scientific | 21720024 | Store at 4 °C in sterile aliquots. |
| #5 Inox Steel Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Can be substituted based on experimenter comfort. |
| 35 x 10 mm polystyrene Petri dish | Corning Life Sciences | Fisher Scientific 08-757-100A | Exact brand and size are unimportant. |
| 75 x 25 mm Microscope Slides | Corning Life Sciences | 2949-75X25 | Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible. |
| Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm | Warner Instruments | 64-0796 | Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells. |
| Vacuum Silicone Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Available from multiple vendors. |
| Glass rods, 5 mm diameter | delphiglass.com | 9198 | Exact size is personal preference, multiple vendors available |
| PAP Hydrophobic Pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Available from multiple vendors. |
| Sealing Film | Sigma-Aldrich | P7668 | Available from multiple vendors. |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | Available from multiple vendors. |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | Available from multiple vendors. |
| Dissecting Stereoscope | Zeiss | Discovery.V8 | Any dissecting stereoscope can be used. |
| UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Rossano et al., 2017 | |
| capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Terhzaz et al., 2012 | |
| c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Sozen et al., 1997 | |
| Single-edged Carbon Steel Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 71960 | Available from multiple vendors. |
| Microscopy Slide Folder | Fisher Scientific | 16-04 | Available from multiple vendors. |
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | 50-110-1231 | Available from multiple vendors. |
| Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs | Genesee Scientific | 32-109BF | Comparable items can be substituted. |
| 2.5 L Laboratory Ice Bucket | Fisher Scientific | 07-210-129 | Available from multiple vendors. |
| 200 uL barrier pipette tips | MidSci | AV200 | Available from multiple vendors. |
| 200 μL variable volume pipette | Gilson Incorporated | PIPETMAN P200 | Available from multiple vendors. |
Citazione di questo articolo
Malpighian Tubule Dissection from an Adult Fly: Isolating an Osmoregulatory and Excretory Organ. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20102, doi: (2023).