細菌細胞の電子Cryotomography

菌体培養のI.準備数mlの液体培養での所望の位相に、通常のメディアで細菌細胞を成長する。より高い濃度が必要な場合は、紡績や新鮮な培地に再懸濁液を採用することができるが、このプロセスは時々、細胞の構造変化を導入することに注意してください。 文化は、汚染物質のと、適切な合流点がないことを確認して光学顕微鏡で確認してください。 いくつかの細菌細胞が付着あるいはEMグリッド上で成長することができます。グリッド、カーボンコートを持つ金のグリッド上で増殖する細胞は、ほとんどの場合、細胞への毒性を回避するために使用されている場合。彼らは、15分間UV光下で滅菌、2分間放電グローである、と液体培養に直接配置してください。接着細胞は、自然にグリッドに固執し、他の人は、コーティングすることによって、グリッド最初にポリ- L -リジン0.1％グリッドを遵守するように要求することができます。細胞の濃度は、凍結する前に適切であることを確かめるために最初は光学顕微鏡のグリッドを確認してください。 II。プランジ​​凍結薄い細胞薄い細菌細胞の場合は、無傷の細胞の懸濁液は、EMグリッド間の凍結突入です。プロセスは、細菌細胞の超構造を保持し、後でEMの高真空中で水の蒸発を防ぐことができます。ここに示すように、それは商業的な自動プランジ冷凍庫、FEI Vitrobot MKIIIで、カスタムメイドのプランジ凍結装置を使用するか、あるいはすることができます。4 2のグロー放電では、カーボンコーティングされたEMグリッド – 4分。これは、このように均等にグリッド全体にわたってサンプルを広めるために貢献し、グリッドの表面が親水性になります。 5パーセントの濃縮BSA溶液の25μlので100μlの金コロイド溶液（10nmの粒径）を混ぜる。 BSAコート金粒子と、これは彼らの凝集を防ぎます。 15分間18000グラムでBSAと金粒子の混合物を遠心してください。上清を除去した後、残りの金のペレットを20μlの細胞溶液と混合される。 BSA処理された金粒子は細胞と反応しないが、それらは断層像の再構成のための基準マーカーとして必要となります。 湿度100％でVitrobotでEMグリッドを放電グローセルとゴールドの混合溶液4μlを適用します。グリッドは、自動的にナンバー1濾紙で両側からしみです。これは、それらのメディアの細胞の唯一の薄膜が残るように、余分な液体を取り除きます。グリッドを液体窒素で約77Kに冷却されるエタンとプロパンの混合液中に急速に急落しています。このプロセスの間、サンプルは、氷結晶の形成は、薄膜<1μmで防止されるように急速に凍結されています。 慎重にエタン/プロパン混合物からグリッドを削除し、すぐに液体窒素下で保存されているグリッドストレージボックスに移す。 III。厚い細胞のセクショ高圧凍結およびクライオ高圧凍結用の利用可能な多くの異なる試料ホルダーがある厚い細胞、高圧凍結が氷の結晶化を低減し、その後のクライオセクショニングは、EMイメージングのための十分な薄いサンプルをレンダリングする。5、6、7の場合、選択はサンプルに依存します、タイプの冷凍機が使用されるか、または調査のアプリケーションが選択されます。ここでは、バルテックHPM 010高圧冷凍庫とライカマイクロシステムズからクライオウルトラミクロトームモデルUC6/FC6を使用してください。 細菌の場合は、15mlsスピナー文化OD> 0.5は、37℃のインキュベータから直接取得され、3分間1000rpmで遠心分離。 15秒間13000rpmで遠心分離後、凍結保護剤および20％デキストランの0.5ミリリットルで、残りの文化ペレットの上清、ミックス0.5ミリリットルを除去した後。 上清を除去した後、スーパーペレットのピペットの0.1ミリリットルは、すでに0.2ミリリットル20％デキストランcryoprotecant（40000Mwt）が含まれているヒートシールマイクロピペットの先端に貼り付けます。 30秒間13000rpmでマイクロピペットの先端で混合物を遠心し、上清を取り除く。 5〜10μlの固いペレットが密封された先端部で見られる。 準備は高圧フリーザーホルダーのアームにマウントされている"テフロン"コーティングされた真鍮のドーム型の硬貨地板は、半分、ドーム内にペーストを受信し、そのフラットなパートナーの真鍮製の帽子で密封されています。 アームアセンブリは、速やかに凍結するための準備がプライムされた高圧の冷凍庫に挿入されます。 2100バールの圧力で細胞を含む複合黄銅の硬貨地板のユニットが急速に高圧の液体窒素の噴射によって冷却されて、瞬時にアームアセンブリを削除し、液体窒素の風呂に急落すると、温暖化から硬貨地板を防ぎます。 凍結切片のために必要になるまで硬貨地板ユニットは、液体窒素下で保存されます。 切片については、細胞のよく冷凍ドームを公開するには、二つの真鍮のplanchetsは慎重に未定義に分離されているR液体窒素。 細胞の完全凍結ドームは、外観のガラス割れと氷核の割れ目の自由です。 この硬貨地板は、予め冷却-170 ° C室に搬送し、クライオミクロトーム逆のようなチャックでしっかりとマウントされています。 冷却cryomicrotomeは切片のために必要不可欠なcryotoolsが含まれている、これらは、次のとおりです。ローアングル低温ダイヤモンドナイフ、ダイヤモンドトリミングツール、プレスのプラットフォーム、グリッドストレージボックス、帯電防止スプレーユニットとグリッド保持装置を。 よく冷凍周囲の〜200μmの深さを維持しながら、外側のドーム領域を切片成功したリボンが最初にダイヤモンドのトリミングツールと迅速なセクショニング速度により<0.2mm角の形状である。用低角度のナイフと近接銅のサポートグリッドに向け帯電防止スプレーを使用して、ダイヤモンドのナイフは、研磨ブロック面切片のために準備ができたに慎重に高度です。 ミクロトームのパラメータは一緒に〜0.4mm/secと狭いカッティングウィンドウの切削速度で、このような50〜350 nmの間で切片厚の設定として、選択されています。すぐ近くに低湿度の条件に静電気防止スプレーの範囲や強度を制御することが重要です。 最初のセクションが生成される微細なまつげのアプリケーターは、低角度のダイヤモンドのナイフエッジをオフにスライド早いセクションを手に入れたい、手やマイクロマニピュレータによって操縦されている。 セクションのリボンがナイフを強制的にオフにしている間、彼らは静かにまつげのプローブによってサポートされており、近くには銅のグリッドのサポートを介して導かれる。 セクションを固執する、リボンでロードされたグリッドがその後しっかりと冷却研磨-銀プローブを使用して押されて、いくつかのセクションでは、その高度に最新の帯電防止装置は、接着プロセスを支援することがご利用いただけます。 グリッドボックスは顕微鏡は、グリッドの転送の準備ができるまで、ドライシッパーを冷却、液体窒素中で長期保管のために保持されます。 IV。クライオ光顕微鏡を用いて細胞を調べますグリッド上の細菌細胞は、クライオ光顕微鏡（cryoLM）を用いて画像化することができます。ここで使用する顕微鏡は、カスタムニコン倒立顕微鏡Tiの余分な長い作動距離を持つE / B（ELWD）60倍の空気の対物レンズです。グリッドは、光学顕微鏡のための修正されたFEIクライオステージであるイメージング、中にクライオステージに保持されます。ファインダのグリッドを使用して、細胞は、グリッドの四角形に配置することができるとcryoLM画像はcryoEMの断層像と相関する。 凍結ステーションのカートリッジにグリッドをロードします。カートリッジは、FEI TF30H – polaraのための私達の標準的なEMのカートリッジから変更したカスタムです。グリッドは、銅のクリップリングで抑えています。カートリッジは、転送するための液体窒素でチューブ内に保持されます。 液体窒素温度（-190℃）にクライオステージを冷やす。 クライオステージにカートリッジをロードし、表示ウィンドウにグリッドを移動する。ステージは、2つのカスタムに変更カートリッジを収容できます。 集光レンズを下げて、グリッド上に60倍対物レンズをフォーカス。 セルを検索し、画像を取る。相関LMとEMの研究のために、グリッドは、EMで後に細胞を見つけるために、細胞の領域の周囲にスキャンされます。 イメージングの後、グリッドには、チューブに戻し、カートリッジを入れて、EMでイメージを作成する準備ができるまで、液体窒素でチューブを保持します。 V.は、クライオTEMでチルトシリーズを収集するサンプルを段階的にクライオTEM内の1つまたは2つの軸に沿って傾いている間に細菌の細胞の3次元断層像を取得するには、投影画像のシリーズを撮影している。チルト角度やその他の実験の設定を考えると、自動的にチルトシリーズを収集するために使用できるいくつかの異なるソフトウェアがあります。我々は、FEI TF30H – polaraである私たちのクライオTEM用Leginonを使用してください。それは自動的に事前に選択されたセルのチルトシリーズを服用することができます。8 予備冷却したクライオステーション上で複数選択ホルダー（MSH）にカートリッジをロードします。 MSHは、6カートリッジを収容できます。 TF30H – polaraにMSHを接続し、一つのカートリッジを選択し、EMの列に挿入します。 EMコンピュータや他のワークステーション上のLeginonメインプログラムにLeginon -クライアントを起動します。 Leginonのセッションのためにプリセットを（画像の条件）を設定します。重要なパラメータは拡大、下のフォーカス値、電子線量と開始角度、終了角度と増分を含むチルトシリーズのための傾斜角度、です。 最も低い倍率から始めて画像上のターゲットを選択し、より高い倍率で次のステップにそれらを送る。 チルトシリーズのコレクションのためのすべてのターゲット上のキューと、最終的な"断層"のステップにそれらのすべてを提出する。 データ収集のプロセスは、ローカルワークステーションからWebツールを介して監視することができます。 実験データの収集がダウンして、行われている後再建のためのローカルワークステーション上に完成したチルトシリーズをロードする。 VI。バイオセーフティに関する注意事項我々が扱う生体試料のほとんどは非病原性であり、土壌、水道水や昆虫の腸から単離されている。基本的な無菌操作には、これらのサンプルを処理するための十分です。病原体での作業は、追加の安全手順の実装を必要とする、しかし、極端な危険のために、いくつかのラボではBSL – 3実験室内全体の低温電子顕微鏡顕微鏡をインストールしている。以下は、我々が研究室で病原体を扱うのリスクが低下している方法の一部です。 サンプルの病原性は、化学的または遺伝的に減衰させることができる。ウイルスの低温電子顕微鏡をやって多くのラボでは、プランジ凍結前に化学固定剤でそれらを不活性化している。別の方法として、キーの変異は、例えば特定の酵素に点突然変異を不活性化または受容体をノックアウトするなどの非感染性、サンプルをレンダリングするように導入することができます。 そのような手袋、白衣やゴーグルなどの個人保護具を着用してください。 危険なサンプルは、バイオセーフティーキャビネット（BSC）で処理することができます。細菌培養は、成長し、濃縮し、BSCのEMグリッド上にさえ、思い切って凍結することができます。我々はこの目的のために私たちのBSCに収まる小さい、手動プランジ凍結装置を持っている。自動プランジ-冷凍庫が提供するより大きな一貫性が必要な場合は、それらはいずれの特定のケースで我々はデバイスの汚染を防ぐために、アルミ箔で私たちのVitrobotのブロッティングパッドをバックアップして、もっと単純に、BSC導入、またはすることができます。 BSCで作業する場合、キャビネットの中に起こったり、外可能な限りのツールや材料の多くは、70％エタノールで消毒してください。私たちのグリッドを準備するとき、我々は、ワットマン濾紙によるブロットされるそのほとんどが細菌やウイルス培養の小さなボリューム（通常4 UL）、使用してください。吸い取り紙、ピペットチップ、および残りの文化は、バイオハザード廃棄物として処分されています。すべてのツールと​​露出された表面は、希薄化後の漂白剤、95％エタノール、次いで水で消毒されています。 グリッドが凍結されると、それらはストレージとデータ収集を通じて、液体窒素の温度で保持されます。これは、細胞が融解して凍結して生き残ることが示されている、しかし、私たちは、ストレージとデータ収集を通じて有害として扱うことを続けています。データ収集の終了時に、冷凍グリッドを含むカートリッジは、クライオTEMから削除され、70％アルコールに直接ドロップ。まれですが、それは時々のグリッドは列の中で"ドロップ"していることに留意すべきである、とこのようなイベントの結果は、それぞれの危険なサンプルのために意図されるべきである。顕微鏡のほとんどが室温になって、ドロップされたグリッド上のサンプルは、おそらくカラムの内部融解と完全にEMの超高真空下で乾燥になるので。これは明らかにいくつかの生体試料を不活性化するだろうが、おそらくない堅牢なウイルス、およびサンプルの乾燥残党は、潜在的に顕微鏡のカラムは次のサービスのために開かれているエアロゾルとして放出される可能性があります。 VII。断層像再構成細菌細胞の断層は、ソフトウェアによって再構築さ​​れます。このジョブで使用可能ないくつかのソフトウェアがあります。自動化されたチルトシリーズのアライメントとその後の再建は重要なタスクであるため我々は自動再構築とスクリーニングの断層像のためのRaptorを使用する9、ラプターは現在100％の成功率を持っていません。ラプターの障害や高品質の再建の必要性が生じた場合は、我々は、IMODの断層のソフトウェアスイートでeTomoとマニュアルの画像の配置と再構築を使用してください。10、11 ローカルLeginon Webサーバから個々の傾斜のシリーズをダウンロードしてください。それらを簡単に配置できるディレクトリに保存します。 手動でIMODの3dmodビューアを使用してチルトシリーズを検査し、Leginonのターゲットを追跡し、有用な傾斜のシリーズを生産失敗した場合にそれらを捨てる。 我々は、Raptorはピーチ （ネットワークを介してタスクを分散するためにパールベースのシステム）を通じて、ラボでLinuxマシンに分散して実行。我々は、金コロイド粒子、すなわち、再建のために使用されるマーカーの数、ピクセルサイズ、再建の所望の厚さ、ビニング要因との数の基本的な設定を（inputなど、私たちの基準マーカのサイズを指定します。出力パスと出力フォーマット）コマンドライン上および実行するためにそれを残し、一般的に20分2H〜122 -イメージデータ（2Kによる2K）用。再建の結果に満足している場合、このセクションでは以下の手順はスキップすることができます。 手動再構築が必要な場合に、"。MRC"からファイル"。ST"に名前を変更し、IMODトモグラフィのスイートでeTomo GUIに個々のチルトシリーズを読み込みます。 チルトシリーズの軸のタイプ（シングルまたはデュアル軸）を指定し、SAで使用されている基準サイズを入力mple準備。ピクセルサイズを決定するために、ファイルのヘッダをスキャンし、"COMのスクリプトの作成"をクリックして進みます。 チルトシリーズから断層像を再構成するためにeTomo GUIの各タブの手順に従ってください。点検し、各ステップの後に結果を確認し、満足していない場合、私たちは常にそこから任意の前の手順と再処理に戻ることができます。 "前処理は、"準備処理を実行し、X線によって引き起こされる異常に高輝度のピクセルを削除することです。 "大まかなアライメントは、"チルトシリーズの後続の各​​投影画像が相互相関によって以前に整列される請求チルトシリーズを生産。我々は、金のビーズが"基準モデルの生成"のフィデューシャルとして利用するかを定義し、プログラムは各投影画像に基準マーカーを追跡し、"ファインアライメント"を構築。 "断層撮影のポジショニングは、""最終的な整列スタックを"Zの断層像をトリミングを線形補間し、そのようなCTF -補正などの機能を使用して生成されることができる、ゴールド、消しゴムと2D -フィルタリングが任意で適用することができます。断層像はフーリエ空間での重み付き逆投影による"断層像を生成する"で計算されます。 "後処理"は興味とスケーリングのXY領域に断層像から対象の構造の範囲でコントラストをトリミングし、中間ファイルを削除する"クリーンアップ"とディスクスペースを解放できます。 VIII。データベース内の断層の記憶我々は、Webベースの社内整理するデータベース、店、検索、および断層のデータを配布を使用してください。それぞれのチルトシリーズでは、我々は、サンプルの詳細、顕微鏡の収集パラメータ、生チルトシリーズだけでなく、関連する3次元再構成および他の処理のファイルを記録することができます。メインのブラウズページにはサムネイル画像を提示し、各断層像のための映画のような機能は"YouTube"、およびエントリはダウンロードの頻度、作成者、試料の種類や日付別に整理することができます。ユーザーがキーワードや特別な機能を入力して、データベースを検索することができます。現在4,500人以上の断層の傾斜のシリーズは、11,000人以上の関連するファイルの合計で、種/試料の約60種類をカバーし、データベースに寄託されています。 IX。断層像の解析とセグメンテーション断層の構造の詳細は、画像処理ツール、ZAP、XYZとスライサウィンドウでIMODの例3dmodビューアで別のソフトウェアで表示および分析することができます。 次のステップは、3D画像（断層像）のセグメンテーションを作成することです。セグメンテーションは、3D画像の各ボクセル（体積のピクセル）になる地域や材料ボクセル属し、例えば、膜または細胞骨格を記述するラベルを割り当てます。我々はそのようなIMODとアミラ（ヴィサージイメージング）の3dmodなどのソフトウェアツールを使用してください。 いくつかのソフトウェアツールは、自動セグメンテーションのモジュール（例えば、しきい値のセグメンテーション）を提供しますが、彼らはしばしば、高いコントラストを持つ画像に対してのみ動作します。低用量電子cryotomographyから派生した3D画像は、ほとんどのケースで我々は手動で各ボクセルにラベルを割り当てる必要があるような低いコントラストを持っている。 セグメンテーションは、別のデータファイルに格納されています。それは各領域が異なる色で示され、3Dで表示されているサーフェスモデルを生成するために使用することができます。 断層は、他の分析に使用することができます。例えば、テンプレートマッチングとその後の計算は、リボソームのような巨大分子複合体の統計情報を得ることができる。サブボリュームの配置と平均化は、より高いコントラストでの構造を示しており、細かい詳細を明らかにする。 X.は、断層像に基づいて映画を作る私たちは、それぞれのプロジェクトを要約すると私たちの断層画像の視覚的なツアーを与えるために映画を作る。 我々はこれらの機能をレンダリングする方法を示すとしたいデータの機能のスクリプトを作成します。例えば、細胞全体の断層撮影のプロジェクトの典型的な映画の中で、我々は、代表的なチルト系列データを示すことによって開始し、その後再建された断層像のスライスバイスライスビューで従ってください。次に、我々は、例えば、べん毛モーターまたは化学受容器の複雑なまたは細胞質フィラメントを細胞内の主要な高分子のセグメント化を示す。最後に、私たちは勉強している高分子の理想的な解釈を示すモデルと結論付けている。 このようなアミラやキメラのようなグラフィックス表現のソフトウェアは、映画の個々の静止フレームのレンダリングに使用されます。我々は通常、各クリップへの変更を容易にするために短いクリップからムービーを組み立てます。 最終的なムービーにムービークリップへの静止フレーム、およびその後のムービークリップを組み立てるためにAdobe Premiereのよ​​うな商業用動画編集ソフトを使用してください。 我々は映画を語りますオーディオトラックを追加し始めている。ナレーションは、"映画の伝説"として機能し、観客は映画を見ながら提示されるデータに集中することができます。 XI。アニメーション視覚的ストーリーテリングは、特定の科学領域の複雑な語彙を必要とせずに知識を伝達する。視覚的なデモの場合、同伴の難しい概念が簡単になります。漫画で生物学的アイデアを説明するの練習は新しいものではありません。ただし、この10年間で本格的な3Dコンテンツ制作の高度なツールは、科学的なアニメーションを構築する作業に耐えるためにもたらされている。積極的にダイナミックな3Dアニメーションへの生物学的システムを変換する研究者数十人が存在することになります。多くの美しいアニメーションは、上に展示されてhttp://MolecularMovies.org 。そのサイトには、チュートリアルをホストし、Autodesk Mayaの分子構造を操作するための無料のツールキットを配布しています。オープンソースの3Dコンテンツのスイート、Blenderは、複数のユーザーによって生成されたPDB輸入業者が含まれています。 3Dアニメーションを作る過程は、一般的に3つの手順を実行します。 モデリング：我々は、Mayaにインポートできる形式に表面をエクスポートするために、グラフィックス表現のソフトウェアを使用する。これらの表面は再構成された断層像からのセグメンテーションのいずれかであり、例えば、膜、顆粒、またはフィラメント、または分子の表面の表現。断層のセグメンテーションは、アミラで実行され、分子の表面は、キメラまたはVMDで生成されます。分子の原子の表現は、PDBファイルからMayaに直接インポートすることができます。モデルは、Maya内にあると、それらは、変更を複製し、必要に応じて配置することができる。 アニメーション：アニメーションは伝統的にアーティストが手作業で動いているオブジェクトを再配置し、キーフレームの連続を記録して、手で構築されています。 3Dグラフィックスソフトウェアの新たな進歩は、今のダイナミクスがモジュールとスクリプトAPIの組み込みを経由して、手続き的に生成することができます。 レンダリング：手続きのダイナミクスは、自己組織化構造などの動的な生物学的過程の説得力のあるアニメーションを、提供することができます。まだ現実的に生物学的システムをシミュレートするのが難しいため、3次元アニメーションの大半は、依然として従来のキーフレームの技術を使用して構築されています。ダイナミクスが整然としていると、視覚的な注釈、テクスチャ、およびライティングの効果が追加される可能性があります。最後に、カメラパスが選択され、完成したアニメーションをムービーにレンダリングされます。