1。ナマルバ細胞を準備してカウント培養フラスコから細胞を除去し、ペレットに細胞を遠心してください。 PBSの既知の量で上清と再懸セルを削除します。このプロトコルで使用されている細胞は浮遊細胞です。あなたが接着細胞を使用している場合には、収集する前にトリプシンする必要があります。 、生細胞の数を決定するカウントスライド上に混合物の0.4％トリパンブルー溶液をピペットを10μlとそれを1:1に混合して細胞懸濁液の一部を染色し、TC10自動化されたセルにスライドを挿入するにはカウンター（バイオラッドラボラトリーズ株式会社）。 TC10セルカウンターは、意志オートフォーカスは、カウントを続行して最も正確なカウントを保証する、とする。それは自動的にサンプル中の生細胞と全細胞の密度が決まります。 ビュースクリーン上のセルを表示する画像を表示する]を選択します。その後、自動的に必要とされる細胞の混合物の量を計算TC10セルカウンタを持つように希釈電卓]を選択します。 この実験は、3種類のsiRNAの合計を使用しています：あるコントロールsiRNAとSTAT6遺伝子、プラストランスフェクトされていないコントロールをターゲットに二つの異なるsiRNAを。これは、1mlあたり5 × 10 6細胞の最終濃度で3.6ミリリットルを必要とします。 希釈計算機に所望の濃度と最終的な音量の値を入力し、それは細胞懸濁液の体積は、そのサンプルの生細胞数に基づいて、必要に応じて計算します。また、手動で計算を実行します。次に、新しいチューブにこれらの実験のために細胞の混合物の必要量を転送する。 細胞をペレット化する細胞の混合物をスピンし、すべてのPBSを取り除く。ジーンパルサーエレクトロポレーションバッファー（バイオラッド社）の3.6 mlで再懸濁します。適切なsiRNAを含むチューブに800μlのアリコートを移し、穏やかに混合する。セルはエレクトロポレーションのための準備が整いました。 2。 96ウェルプレートに細胞をElectroporating 96ウェルエレクトロプレートが一緒にエレクトロポレーションするすべての4つの治療のために複製することができます。 96ウェルエレクトロプレートの適切なウェルに細胞懸濁液150μlを移す。 MXcellのエレクトロポレーションプレートをチャンバー内にプレートを挿入し、蓋を閉じます。 使用されている細胞株とバッファ用に最適化された設定を使用してエレクトロ。これらの細胞は、指数関数的な減衰の250 Vの機器の設定と波、350μF、および1000Ωの抵抗を使用して電気穿孔されています。 エレクトロポレーションが完了した後、混合し、その後、予め温めておいた培地を含む組織培養プレートに細胞を転送するために各ウェルに優しく上下にピペッティングし。ナマルバ細胞を7.5％FCS、1％ピルビン酸を添加したRPMI（ライフテクノロジーズ）で栽培されています。 エレクトロされて​​いないコントロールサンプルは、残りの細胞懸濁液から採取し、同じようにエレクトロポレーションした細胞に予め温めておいた培養液の培養皿に追加されます。 37℃で一晩培養する° C、5％のCO 2。 24時間後、細胞の一組は、10 ng / mlの最終濃度が組換えIL – 4（R＆Dシステムズ）を誘導した。コントロール細胞の2番目のセットは、追加のメディアを受け取ります。すべての細胞は37℃、5％CO 2でさらに24時間インキュベートする。 3。 RNAを抽出し、確認してください成長の48時間の合計した後、各ウェルの細胞をカウントし、RNA抽出のためのマイクロチューブに各ウェルから一アリコートを転送し、ウェスタンブロット法または他のタンパク質分析のための第2のアリコートを凍結する。 細胞をペレット化するためにサンプルを遠心分離し、各チューブから上清を除去し捨てる。 RNAの抽出を続行します。我々は一般的に含まれているプロトコルに従ってAurumトータルRNAキット（Bio – Rad）を使用してください。 分解したRNAは、誤解を招くような結果を与えるので、siRNAを介した遺伝子ノックダウンを監視する場合には、RNAの品質を検証するために特に重要です。 280分の260の比はRNAの完全性を示すものではありませんしたがって、それは、RNAが分解されていないことを確認するためにゲルやマイクロ流体デバイス上でサンプルを実行することが重要です。 ワンステップの質と量の両方を評価するために、これらのサンプルはExperion自動電気泳動システム（Bio – Rad）を用いて分析されます。 最初に、熱のサンプル。その後、プライム、負荷、および渦Experion RNAチップ。 Experion電気ステーションにチップを挿入し、実行を開始します。 実行が完了したら、Experionソフトウェア（従来のRNAに似たれるエレクトロ、結果表の形式（RNAの濃度、リボソーム比、およびRNAの品質指標番号を表示する）、および仮想ゲルに自動的に結果が表示されます。ゲル）。高品質のトータルRNAサンプルは、通常、8〜10のRQIを持つことになります。 </LI> 4。リアルタイムPCR RNAの品質を確認した後、cDNAを反応に進んでください。この実験は、1回の反応でcDNAを合成し、リアルタイムPCRを組み合わせることiScriptワンステップRT – PCRミックス（Bio – Rad）を使用。 各プライマーセットのRNAテンプレート以外のすべての反応成分を含むマスターミックスを作成し、PCRプレートに、それらを配布する。 均一な濃度にRNAを希釈した後、適切なウェルにRNAサンプルを追加。各反応は三重に設定されています。 プレートをシールし、CFX384リアルタイムPCRシステム（Bio – Rad社）に配置します。適切なプロトコルを選択して、実行を開始します。 実行が完了すると、遺伝子発現は、コントロールsiRNAをエレクトロポレーションした細胞の同正常化への実験的siRNAをエレクトロポレーションした細胞のリファレンス遺伝子に正規化された目的の遺伝子の遺伝子発現を比較することによって決定されます。 5。 siRNAのノックダウンの解析 CCL17の発現は、CCL17のIL – 4依存的誘導に転写活性化因子STAT6の役割を調べるために定量的リアルタイムPCRを用いてモニターした。この実験では、GAPDHは、参照遺伝子として使用した。代替のリファレンス遺伝子または複数のリファレンス遺伝子は同じ方法で使用することができます。 CFXマネージャーソフトウェアを自動的に同じサンプルから参照遺伝子の発現にCCL17の発現を正常化し、自動的に単に"基準"と対照治療としてGAPDHを選択することにより治療を制御するために、結果として得られる正規化された値を比較した（IL​​ – 4誘導することなくコントロールsiRNA）としてCFXマネージャーソフトウェアの実験の設定ウィンドウの"コントロール"。 IL – 4誘導することなく、CCL17の転写は、対照治療に匹敵する低い、構成的な水準で推移。 IL – 4で誘導され、通常のSTAT6経路（すなわち、コントロールsiRNAまたはトランスフェクトされていないコントロールトリートメント）保持する細胞はCCL17発現の8-10倍の誘導を示した。 IL – 4ではなくSTAT6式のいずれかSTAT6 siRNAの導入により阻害と誘導された細胞はCCL17のIL – 4誘導発現におけるSTAT6の役割を確認する非誘導細胞よりも約2倍高いCCL17の発現を示した。 6。代表的な結果 図1。 IL – 4シグナル伝達経路の概要。 その受容体へのIL – 4の）結合は、STAT6の二量体化と活性化につながる。核に移行しSTAT6を活性化し、そのようなCC17として、その標的遺伝子の転写を活性化する。 B）IL – 4誘導がなければ、CCL17の転写は低く、構成的なレベルで維持されます。 C）STAT6遺伝子のsiRNAによるサイレンシングの後、IL4による治療は、CCL17発現のほとんど、あるいは全く増加につながるはずだ。 図2。 IL4により、CCL17の誘導は、定量的リアルタイムPCRによって異なる条件で測定。 A）IL – 4なし栽培のサンプルは関係なく、遺伝子発現の発現の低い構成的レベルを持っていた。 B）緑と青で示すように、対照試料には、IL – 4による処理に通常対応し、CCL17の8-10倍の誘導を。しかし、赤やピンクに示すようにSTAT6をターゲットにしたsiRNAでトランスフェクトされた細胞は、STAT6演劇CCL17のIL – 4誘導発現における役割その考えを支持する、IL – 4に対応してCCL17の発現を減少していた。