初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

1日目。ガラス製カバースリップの殺菌、コーティング。 オートクレーブにガラスの顕微鏡のカバーグラスを滅菌乾燥させます。 あらかじめ滅菌四ウェル細胞培養皿の二つウェルに滅菌カバーグラスを置きます。 午前1時01 ポリ- L -オルニチンとラミニンでカバースリップは、4℃で一晩20％ ウシ胎児血清（FBS）を添加したコート℃に 400μLポリ- L -オルニチン（4で保存されている0.01％のソリューション° C） 400μLラミニン（-20アリコートに保存されて50μg/ mlのストック溶液° C） 200μLFBS（-20℃でアリコートに保存されている） 150℃インキュベーターで解剖ツールが一晩熱滅菌する。 10％の血清および10 mg / mLのアンピシリンを含む培地を加えます。 90mLのダルベッコ改変イーグル培地 5 mLのFBS（-20℃でアリコートに保存されている） 5mLのウマ血清 （-20℃でアリコートに保存されている） 10μL アンピシリン （4℃で保存されて10 mg / mlのストック溶液° C） 2日目。コルチ器官の単離。 正流の解剖のフードを滅菌する 。 20分間UVライトをオンにする 70％エタノールですべての面をスプレーし、使用前に5分を待つ。 オペレーティングはさみを使用して大後頭孔の基部に子犬マウスを（P4）首を切る。 簡単に言うと70％エタノールを含む10cmディッシュで頭を洗う。 手術用メスの刃を使用して表皮を削除します。 手術用メスの刃を使用して矢状縫合に沿って頭蓋を開いて、前脳を二等分する。さらに解剖のための尾側前脳を維持する。 鈍的切開を用いて前脳、小脳と脳幹を削除します。 側頭骨（図2A）を削除し、70％エタノールで簡単にそれらを浸し、そして滅菌HBSSを含む3 mmディッシュに移す。 鉗子を使用して 、側頭骨錐体部から水疱と周囲の組織を削除します。 巻き貝形の蝸牛（図2B）を見つけて、ピンセットを使用して前庭系から分離する。 開発のこの段階では、骨迷路は完全に石灰化されていないと簡単に鉗子を用いて解剖される。基端から開始し、鉗子を使用してapically移動慎重に分離による蝸牛の骨迷路を削除します。 らせん靱帯とコルチ器の接続された器官は蝸牛軸（図2C）のスパイラルに沿って巻かれている。慎重にピンセットを使用して、ベースのフックの領域でらせん靱帯を確保し、apically移動すると、それをほどくことによってコルチ器官を取り除く。 ベースから始まる、 第55細かい鉗子 （図2D）を使用してコルチ器官かららせん靱帯を削除します。 コルティ感覚上皮（オプション）の臓器のマイクロ分離。 2つを使用して、ベースのコルティフック領域の臓器を取り除く½ ccのインスリン用注射筒を恒久的に接続されているU – 100 28G ½鉗子のような針で。 頂点から開始し、内有毛細胞の行からスパイラル輪部を削除し、（図2E – F）basally進みます。 コルチ器外植片の器官をめっき 培養ウェルからpoly-L-ornithine/laminin/FBS溶液を除去し、培養液の130μlを加える。 よくと東洋文化の中でコーティングされたガラスのカバースリップ有毛細胞の繊毛が上を向くように外植片にコルチ器の解剖臓器を転送する。 200μLピペットを用いて培養ウェルの培養液を除去。基底膜がコーティングされたガラスのカバースリップで固体接触することを確認してください。 慎重に200 mLのピペットを用いてコルチ器官に培養液の130μLの。コルチ器官の表面に2滴を適用してから、ゆっくりとカバースリップの側に、残りのボリュームを追加します。コルチ器官が培地に浮遊するが、カバースリップに貼られたままにしていないことを確認してください。 37 5％CO 2存在下で° Cで一晩インキュベートする。 3日目。コルチ器の培養臓器へのレポーター遺伝子のエレクトロポレーション。 コルチ器の文化の臓器から培養液を取り外します。 1分を130μLH 2 Oを追加してから、200μLピペットを使用して削除します。 プラスミドDsRedをレポーター（-20℃で保存2mgを/ mLのH 2 O）の30μLを追加。 ようにマイクロマニピュレーターを用いてエレクトロの電極を進めるアノードNDカソードは、文化のいずれかの側にあります。 コルティの移植片培養の臓器にレポーター遺伝子をエレクトロにパルス（27V、30ミリ秒持続時間、10種類のパルストレイン）を生成する。 オプション：modiolarと植のらせん靱帯の両側に、導入遺伝子のエレクトロポレーションを確保するためにパルスの極性を逆に。 5分待ってください。 DNA溶液 （2部DNAのトランスフェ3部）：のFugene 6 130μLを加える。このソリューションは、前の層流フードで3 mLの丸底ポリスチレン試験管を用いてエレクトロポレーションの手順（ステップ20）の開始に準備する必要があります。このソリューションを作成するには： 試験管にのOpti – MEM（4℃で保存）2.4μLを加える。 試験管にのFugene 6試薬0.6μLを（4℃で保存）を追加します。のOpti – MEMに直接トランスフェを追加し、試験管の側面との直接接触を避けるようにしてください。 1秒間ボルテックスする。 室温で5分間インキュベートする。 2.0μLDsRedをレポータープラスミド二本鎖DNA（100μgのDNA / mLのH 2 Oのアリコートで-20℃で保存）を追加します。 1秒間ボルテックスする。 室温で15分間インキュベートする。 培養液200μLを加える。 1秒間ボルテックスする。 ° C、5％CO 2で37℃で一晩インキュベートする。 ウェル培養に2mLの培養液を追加し、37℃で10日までインキュベートする。 代表的な結果我々は、周産期のマウスからのコルチ器官の単離のための方法を提示する。手順は、骨迷路が十分に解離が面倒なレンダリングに石灰化になる時点で、生後約最大16日胚のように若いマウス6で使用することができます。コルチ器官が解剖されると、それは全体（図3）やマイクロ分離された感覚上皮（図4）のいずれかで播種し、培養することができる。今後は、コルチ器の培養器官で外来遺伝子を表現する手法を提示している。器官培養は、らせん神経節細胞またはマイクロ分離を用いた外因性幹細胞とコルチ器官共培養、そのようなRT – PCRを用いてコルチ器の遺伝子発現の臓器の分析として、またはin situハイブリダイゼーション研究の他の多くの種類、のに便利です。 3、または有毛細胞の死と再生のインビトロ分析インチ 図1。コルチ器のP4マウス臓器の断面。 （A）P4マウスから得られたcryosectioned蝸牛の基底回転からのクロスセクションでは、このプロトコルで説明されているマウス蝸牛の一般的な構造を示しています。中央階は、下方スパイラル靭帯と横方向に血管条、ライスナーの上方に膜、内側螺旋縁、および基底膜に接しています。ボックスには、Bに拡大領域が（B）コルチ器官が基底膜の優れた側に位置し、内有毛細胞、外有毛細胞の3つの行、および、それぞれの支持細胞の一つの行が含まれています示した。破線1は、コルチ器の解剖のこの臓器中に削除される基底膜に沿って位置を示します。破線2は、マイクロ分離手順の間に除去される基底膜に沿って位置を示します。グリーンはスパイラル輪部の歯間細胞、蝸牛有毛細胞、らせん神経節の神経細胞だけでなく、らせん靱帯と血管条7の細胞を標識するカルビンジンの免疫組織化学的標識を、示している。核のDAPI標識は青色になります。 図2。コルチ器の解剖の臓器。コルティ郭清のハイライトの器官の付属のビデオからの画像）は蝸牛と分離された側頭骨（赤）、B内にある前庭系）蝸牛の骨迷路、C）らせん靱帯と接続されている骨迷路、Dの除去後のコルチ器官）コルティ、Eの臓器かららせん靱帯と血管条（赤）の除去）スパイラル角膜輪部（赤）からの感覚上皮のミクロ分離、およびF）分離されたスパイラル角膜輪部（左）と感覚上皮（右）。 図3。の臓器を示すコルチ植の培養臓器。DIC画像分離されたP4 ATOH1 – nGFPマウスのコルティ、メッキ、と説明したとして、5日間培養した。プロ毛細胞の遺伝子無調相同体1（ATOH1別名Math1を）発現する細胞は、核8にローカライズされている緑色蛍光タンパク質を示すように、このマウスは遺伝的に設計されています。これらのマウスからのコルチ器官は、すべての有毛細胞の核で核GFPのラベルを示すため、落射蛍光顕微鏡を用いて感覚上皮の簡単な可視化を可能にする。比較的大きな渦状角膜輪部は、感覚上皮の外側を見ることができます。コルチ器官から発生した間葉系細胞は、外植片から移行しています。青い核のラベルはDAPIです。 図4。マイクロ分離された感覚上皮に説明し、一晩培養したとしてコルチP4マウス臓器から単離された感覚上皮から得られる。落射蛍光画像。マイクロ分離は、その後4％パラホルムアルデヒドで固定し、蝸牛の有毛細胞を標識するミオシン7aの免疫標識のために処理した。図3から比較的大きな螺旋縁がないことに注意してください。青い核のラベルはDAPIです。 図5。コルチ器の培養臓器にDsRedをレポーター遺伝子のエレクトロポレーション。コルティの全器官がP4 ATOH1 – nGFPの仔マウスから、メッキ、分離して、DsRedをレポーター遺伝子でエレクトロ説明するようにして、落射蛍光顕微鏡下で観察した。トランスジェニックDsRedをレポータータンパク質を発現するコルチ植の臓器の細胞は感覚上皮の赤色蛍光と内因性の細胞を示す緑色の核の蛍光を示す。トランスジェニック細胞は螺旋輪部と感覚上皮を通して見ることができます。