Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Taze 50mm Cacodylate tampon% 12.5 Glutaraldehyde (pH7.4), 20 ml'lik cam sintilasyon flakon içeren bir fiksatif çözüm 2ml hazırlamak. N-heptan 8 ml eklenir ve şiddetle çalkalanır. Iki aşamada ayrı bir izin verin. Üst faz, yer, n-heptan glutaraldehid ile doymuş içeren, temiz bir sintilasyon şişenin içine çıkarın ve bir kenara koyun. Bu sabitleştirici bir çözüm olacaktır. Çıkarılabilir bir süzgeçin küçük bir sepet, bir embriyo toplama odası, 0-20 saat embriyolar toplayın. 2-3 dakika süreyle% 50 oranında çamaşır suyu çözeltisi embriyolar iliklerine dış koryon zarı Kaldır veya embriyolar çamaşır suyu yüzeyinde yüzen kadar. , Bir kağıt havlu üzerine ddH20 ve leke embriyolar ile iyice durulayın. Forseps kullanarak, embriyolar mesh düşmesine izin fiksatif çözüm içine dechorionated embriyolar ve yer ile kaplıdır süzgeçin pick up. Embriyolar 4 1,5 saat düzeltmek için ° C bir Nutator karıştırma sırasında izin ver. Çift taraflı bant ile kaplı bir Petri kabı hazırlayın. Yeniden süspanse kullanarak fiksatif embriyolar çıkarın ve yapıştırıcı bant çözme fiksatif heptan önlemek için Petri dish.Transfer bantlanmış yüzey fiksatif çözüm asgari bir miktarı embriyoları üzerine koyun. Embriyo tek bir katman yapmak için Petri kabı çalkalayın. Heptan buharlaşır kadar kaput Petri kabı yerleştirin. Embriyoların karşılamak için yeterli PBS +% 0.1 Tween20 ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, künt bir tungsten iğne ile El-devitellinize geç dönem 16 embriyolar. 1.5 ml mikrofuge'de tüpünün içine tamamen yeniden süspanse embriyolar kurtarın. 5-7 Bu mikrofuge'de tüp içinde yürütülmektedir. 0.1M Cacodylate tamponu, pH 7.4 embriyoların durulayın ve sonra 0.1M Cacodylate Tampon pH 7.4, oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 1'lik osmiyum tetroksit içeren bir çözüm sonrası düzeltmek. 0.1M Cacodylate tamponu, pH 7.4 olan embriyolar durulayın. Etanol ve aseton kademeli dizi embriyolar dehydrate. 10 dakika boyunca% 70 etanol ile 10 dakika boyunca% 50 etanol ile embriyolar dehydrate. Sonra 10 dakika ve 10 dakika her iki% 100 aseton adımları için% 90 aseton kurutmak. Aseton çıkarın ve sonra 1:1 EPON Spurr reçine ekleyerek infiltrasyon işlemine başlamak: aseton karışımı embriyoların. Mikrodalga, vakum basıncı altında örnek tutarken Pelco Biowave Pro mikrodalga kullanarak üç dakika için. Mikrodalga sona erdikten sonra ek bir beş dakika için örnek vakum basınç uygulayın. Exchange 01:01 reçine,% 100 EPON Spurr reçine ve mikrodalga ile tekrar vakum basınç altında aseton karışımı. Vakum basıncı altında Exchange% 100 EPON-Spurr reçine son bir kez, ve mikrodalga. Tamamen yeniden süspanse kullanarak, embriyolar, bir silikon gömme kalıp mikrofuge'de tüp aktarılır. Embriyonun arka ucundaki kalıp konik kenarı ile hizalar böyle bir satır içine embriyolar hizalayın. 70 ° C fırında gecede pişirin. Örnek çıkarın ve kesit için hazırlamak. Diamond Histolojik Bıçak ve Richert Ultracut E Mikrotom kullanarak 1 mikrona kadar bölümleri kesme başlayın. Ilk embriyo bölümüne ulaşıldığında dikkat edin. Bu açıdan bakıldığında, numune içine 100μm kesti. Bir döngü kullanarak bir bölümü çıkarın ve bir bardak slayt üzerine yerleştiriniz. Kısaca, sıcak bir plaka üzerinde bölümünde ısı. Bir damla metilen mavisi kullanarak bölüm Leke. Kalp lümen ışık mikroskobu altında tanımlamak. Diamond Ultra 45 ° Bıçak ve Richert Ultracut E Mikrotom kullanarak 90nm kesitler. Pick up bakır ızgara üzerinde birden çok bölüm. Izgaralar, on dakika boyunca% 50 etanol doymuş% 3 uranil asetat ile boyanmış ve daha sonra çift distile su içinde üç kez durulanır. Sonra, ızgaraları NaOH pelletleri içeren bir CO 2 serbest bir ortam oluşturmak için bir oda 2.5 dakika boyunca kurşun sitrat (10ml çift distile su ve 100ml 10M NaOH çözünmüş 0.04gms) ile boyandı . Izgaraları çift distile su içinde üç kez durulanır. Bölüm 80Kv JEOL 1200EX bir elektron mikroskobu ile incelenmesi ve AMT bir dijital kamera ile fotoğraflandı.