Внутриядерных микроинъекции ДНК в диссоциированных взрослых млекопитающих Нейроны

I. Подготовка к инъекции В этом разделе описываются предварительные шаги, которые должны быть приняты до инъекционных кДНК в ядре нейронов. Процедура изоляции нейронов выходит за рамки данной статьи, но важно, чтобы нейроны распадается на отдельные клетки и придерживаясь хорошо, чтобы нижняя поверхность 35 мм блюда культуры клеток (см. обсуждение за полезные советы для достижения этой цели). Хотя различные нейроны потенциально могут быть использованы, периферических ганглиях, таких как верхних шейных ганглиев (SCG) или спинной ганглий корень являются предпочтительными для вскрытия, так как они удобно доступной и выход большого числа нейронов. Дополнительные преимущества использования SCG нейронов, что они являются относительно однородной популяции клеток и хорошо характеризуется 1,2,3,4. А. Подготовка плазмиды кДНК для инъекций Для предотвращения порчи или поломки ДНК, перчатки следует надевать во время подготовки. ДНК, кодирующую белок интерес субклонировали в подходящий вектор млекопитающих выражения, такие как PCI (Promega, Madison, WI), под регулирование высоко и конститутивно цитомегаловирус (ЦМВ) промоутера. Если белок не помечены, репортера плазмиды, кодирование EGFP например (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Пало-Альто, Калифорния), совместно с впрыском для подтверждения успешной закачки и выражения. ДНК выделяли с использованием высокой колонне разделения качества (например, QIAfilter Midi-приготовительные комплекта Qiagen, Chatsworth, Калифорния) и далее очищают с использованием центробежного фильтра блок с PVDF фильтр (0,1 мкм, Millipore, Bedford, MA) для удаления частиц в плазмидной ДНК, которая может затруднить введение пипец во время процесса впрыска. Плазмиды хранятся при температуре -20 ° С при концентрации около 1 мкг / мкл в соответствующий буфер хранения ДНК (например, TE буфера: 10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Непосредственно перед микроинъекции, плазмиды кДНК разводят и перемешивают до желаемой конечной концентрации в ТЕ буфере или H 2 O. Как правило, 5-10 нг / мкл репортер гена достаточно для обозначения вводили клетки, и полная концентрация кДНК для инъекций не должна превышать 200 нг / мкл с ДНК вязкой при высоких концентрациях и может забить инъекции пипец. Небольшой объем кДНК для инъекций (5-10 мкл) получают путем смешивания капель раствора на чистую поверхность небольшой кусочек парафильмом (сторона под бумажной основе). Смешайте капель раствора вместе pipeting вверх и вниз несколько раз pipetor и избежать введения пузырьков воздуха в процессе перемешивания. Использование кончиком пипетки microloader (Эппендорф, Brinkmann Instruments, Westbury, Нью-Йорк), передачи кДНК решение специально подготовленные гематокрита трубки (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания). Смотрите материалы раздела Инструкции по подготовке труб гематокрита (Материалы таблицу). Место гематокрита трубки, содержащей кДНК инъекционного раствора в 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Центрифуга трубки в течение 15-30 мин при 10 000 г в микроцентрифужных оснащен фиксированным углом или качается ведро ротора (Eppendorf), при комнатной температуре (20-24 ° С) для осаждения частиц в кДНК решение, которое может блокировать микроинъекции пипетки. КДНК инъекционного раствора можно хранить при комнатной температуре в течение инъекции сессии. Б. Изготовление инъекции пипец Одноразовые пипец микроинъекции стекла имеются в продаже (например, Femtotips, Eppendorf), которые удобно, но дорого ($ 10 за микроинъекции пипетки). Инъекция пипец может быть изготовлен в лаборатории с использованием программируемых Р-97 Flaming Браун съемник пипетки (Саттер Instrument Company, Новато, Калифорния) и filamented, тонкостенные боросиликатного стекла капилляров (инструменты Всемирного Precision, Сарасоте, штат Флорида). Этот вариант является более экономически эффективным и позволяет управлять микроинъекции форму пипетки и размера. Двухступенчатая программа используется для узкого тянуть советы пипетки микроинъекции. С момента открытия микроинъекции пипец слишком узок, чтобы изучить под световым микроскопом, качество инъекции пипец должны быть оценены непосредственно путем введения нескольких клеток до настройки программы завершена. Следующие приблизительные параметры тепла, тянуть, скорости и времени: (тяга 1) 600, 115, 15, 250; (тянуть 2) 640, 130, 65, 200. Эти параметры меняются в зависимости от различных партий стекла и по условию нагрева нити в съемника, и должны быть скорректированы по мере необходимости. Для получения дополнительной информации см. 5. Потяните несколько (2-5) инъекций пипец на чашку нейронов для инъекций, в случае повреждения или проблемы во время инъекции сессии. Магазин инъекции пипец в закрытой емкости, чтобы предотвратить попадание пыли кончиком пипетки микроинъекции. II. Внутриядерных микроинъекции палатке "> В этом разделе подробно процесс инъекционных кДНК в ядре нейронов. микроинъекции основные настройки включает в перевернутой фазово-контрастной микроскопии (например, Nikon Diaphot TMD, Nikon, Мелвилл, штат Нью-Йорк) для визуализации процесса, микроманипулятора (например, Eppendorf 5171), чтобы контролировать движение инъекции пипетки и давление инжектора (например, Eppendorf FemtoJet Express) изгнать кДНК решение от пипетки. Подключение давления инжектор микроманипулятора позволяет синхронизацию Последние два процесса во время инъекции. Другие обязательным, но настоятельно рекомендуется, компоненты включают в себя установленный системой видеонаблюдения (CCD камера, Cohu Inc, Сан-Диего, Калифорния; черно-белый видеомонитор, Sony Corporation, Токио, Япония). Эта система не является обязательным требованием для инъекций; Однако, черно-белый монитор обеспечивает более высокую контрастность для улучшения визуализации в ядро ​​клетки и предлагает более комфортной работы во время длительных сеансов инъекций. Кроме того, портативный компьютер под управлением программного обеспечения для работы ручной контроллер может быть использован для полу- автоматизировать процесс инжекции (см. Обсуждение право). Идеальное время для введения SCG нейронов составляет 3-6 часов после диссоциации. На данном этапе клетки имеют сферическую форму, плотно прикреплена к нижней части блюда, и ядро ​​отчетливо видно, под фазово-контрастной микроскопии, в качестве центрального круглого органелл с темной оболочкой, содержащие один или несколько ядрышек (рис. 1А). Место блюдо диссоциированных нейронов в центре столик микроскопа. Настройте фокус и оптимизации фазового контраста оптики микроскопа так ядрах нейронов, четко видны. Внесите 2 мкл кДНК подготовлено решение в микроинъекции пипетки использованием наконечника microloader пипетки. Избегайте составления решения в нижней части трубки гематокрита, так как это может активизироваться частиц, которые поселились во время центрифугирования. Нити в микроинъекции пипец должно помочь в разработке решения кончик, но если маленькие пузырьки воздуха не проходят, мягко Флик стороне стекла, чтобы выбить их. Вставьте микроинъекции пипетки в капилляр обладатель давление инжектора и закрепите держатель микроманипулятора. Держатель крепится под углом 45 °. Нижняя микроинъекции пипетки на блюдо. Как пипетка входит культуральной среде, образуется мениск, который влияет на преломление света и снижает качество изображения нейронов. Чтобы решить эту проблему, башни фазе кольца можно слегка компенсировать до ядрах нейронов четко видимым. Некоторые системы давление впрыска у "чистых" функций, которая применяется максимальное давление воздуха из кончика пипетки микроинъекции на короткое время. Используйте эту функцию, чтобы очистить пипетка мусора перед началом и во время инъекции, если кончик появляется забиты. Если развеял жидкости не видно на экране при использовании этой функции, замените ее на новую пипетку инъекции. Центр микроинъекции пипетки в просмотре монитора и выровнять кончика рядом нейронов и в той же фокальной плоскости, как ядрышко. Установить эту позицию в качестве нижней оси Z. ограничение на микроманипулятора. Эта позиция глубиной микроинъекции пипетки будет заранее, чтобы во время инъекции. Теперь положение кончика приблизительно 30 мкм выше этой точки так микроинъекции пипетки очищает верхней части нейронов. "Вводить" режим Эппендорф 5171 микроманипулятора может быть определено со следующими параметрами для выполнения внутриядерных инъекций. Инъекционные функция установлена ​​на, в то время прокалывать функция была прервана. Диагонали инъекций (по х и г-ось) производит наименьшее количество повреждения клеток и таким образом осевой режим должен быть использован для инъекций. Скорость впрыска 300 мкм / с достаточно, и синхронизировать повышения давления при микроинъекции пипетки достигает заданного оси предела. Давление инжектора контроля количества кДНК решение вводится в ядре. В "автоматическом" режиме инъекции, доставка ДНК в установленное время и инициированный связано микроманипулятора. Давление впрыска (Pi) должен быть установлен в диапазоне от 100 до 200 гектопаскалях (гПа; 1 гПа ~ 0,015 фунтов на квадратный дюйм); выше давление впрыска не улучшаются показатели эффективности и качества инъекций и может указывать на другие проблемы с кончика пипетки микроинъекции размера или ДНК чистоты . Впрыска (TI) в размере 0,3 с и компенсации давления (PC) от 30 гПа, которая обеспечивает постоянное положительное давление, чтобы избежать вступления окклюзии частиц из культуральной среды в пипетку наконечник, должны быть использованы. Позиция нейрона, который будет введен под кончиком пипетки микроинъекции использованием ху оси стадии микроскопа контроля. Совместите кончика пипетки над центром ядра, сосредоточив внимание туда и обратно между тОн наконечник и ядрышки. Inject ядра, нажав кнопку вводят (на микроманипулятора). Для инъекций шаг, движение пипетки микроинъекции и освобождение кДНК решения контролируются микроманипулятора. Трудно подтвердить успешное внутриядерных инъекции на глаз, но инъекции относительно низкой вязкостью кДНК решение (по сравнению с вязкой ядерной окружающей среды), часто появляется в виде белого шлейфа под фазово-контрастной оптики и может быть использован как индикатор инъекции в ядре. Иногда микроинъекции пипетки не проникает ядерной мембраны и просто толкает ядро. Вторая попытка инъекции в том же положении может привести к успешной инъекции ДНК в ядре. Отек ячейки, как правило, свидетельствует о непреднамеренном цитоплазматической инъекции. Кроме того, значительную ядерную опухоль не очень хорошо переносится нейронов и обычно приводит к гибели клеток вскоре после этого, таким образом, давление впрыска и продолжительность не должна превышать рекомендуемые значения. Продолжить инъекционные нейронов путем перестановки столике микроскопа для выравнивания следующего нейрона при микроинъекции пипетки. Систематически перемещаться по блюду придать примерно 50-100 ядер, прежде чем вернуться блюдо нейронов в инкубатор для инкубирования в течение ночи. Успешно вводят нейронов можно выделить следующий день выражение гена-репортера. III. Представитель Результаты Рисунок 1: верхний шейный ганглий (SCG) нейронов. Фазового контраста образ SCG нейронов 3 часа после диссоциации (). На этом этапе ядро ​​отчетливо видна, которая помогает выравнивание кончика пипетки микроинъекции. Ядре появляется в центре нейронов с одной (левой) или несколько (справа) темными ядрышками. SCG нейронов 16 часов после инъекции EGFP кДНК в ядре (В). Левые, SCG нейронов рассматривается под фазово-контрастной подсветкой. Правильно, epifluorescent изображения тех же нейронов показывает успешный инъекции и в результате EGFP выражение в одном нейроне. Белые шкалы составляет 20 мкм. Рисунок 2: Цельноклеточная записи токов через heterologously выраженным G-белком внутренне исправления K + (GIRK) каналов из SCG нейронов. GIRK токов (я GIRK) были вызваны 200 мс напряжение рампы от -140 до +40 мВ от проведения потенциал -60 мВ (вставка) после активации эндогенных α 2-адренорецепторов на норадреналина (NE, 10 мкм) . Наложенные следы записи из того же нейрона и указать ранее (черный) и после применения либо NE в одиночку (синий) или СВ плюс 10 мМ Ba 2 + (красный). Пунктирные линии показывают нулевой текущем уровне. Для записи я GIRK, внешний раствор содержал (в мм) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 2 CaCl, 0,8 MgCl 2, 15 глюкоза, сахароза 15, 0,0003 и ТТХ, доводили до рН 7,4 с помощью NaOH. Внутреннее решение записи, содержащиеся (в мм) 135 KCl, 11 EGTA, 1 2 CaCl 2, MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP и 0,3 Na 2 ГТФ, доводили до рН 7,2 с КОН. Отсутствие текущих вызванными напряжением рампы в присутствии НЭ в uninjected нейроны SCG () показывает, что нейроны SCG не выражают эндогенных каналов GIRK. Успешное введение плазмиды кДНК, кодирующую функциональный GIRK канал 11 порождает большие токи при напряжении рампы при воздействии на северо-восток (B, слева). Токи имеют типичные характеристики токов через каналы GIRK: активация G-белком рецептор агонистов (NE), внутрь ректификации, и блок токов предполагаемого блокатор канала GIRK, Ba 2 + (B, правый след красного цвета). Открытые и наполнил кружки я GIRK в холдинг и пикового тока, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.