Microinjection d'ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

I. Préparation pour l'injection Cette section décrit les étapes de préparation qui doivent être prises avant l'injection d'ADNc dans le noyau des neurones. La procédure d'isolement pour les neurones est au-delà de la portée de cet article, mais il est important d'avoir les neurones dissociés en cellules individuelles et adhère bien à la surface inférieure de 35 mm plats de culture de cellules (voir discussion pour des conseils utiles pour atteindre cet objectif). Bien qu'une variété de différents neurones pourrait potentiellement être utilisé, les ganglions périphériques tels que les ganglions cervicaux supérieurs (GCS) ou les ganglions rachidiens sont préférés pour la dissection, car ils sont facilement accessibles et le rendement d'un grand nombre de neurones. Autres avantages de l'utilisation de neurones SCG sont qu'ils sont une population relativement homogène de cellules et bien caractérisés 1,2,3,4. A. Préparation du plasmide d'ADNc pour l'injection Pour éviter la contamination ou de panne de l'ADN, les gants doivent être portés lors de la préparation. ADN codant pour la protéine d'intérêt est sous-cloné dans un vecteur d'expression mammifère approprié, tel que pCI (Promega, Madison, WI), sous le contrôle du cytomégalovirus (CMV) fortement et constitutivement active. Si la protéine n'est pas étiqueté, un plasmide rapporteur, EGFP encodage par exemple (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), est co-injecté pour confirmer l'injection de succès et d'expression. L'ADN est isolé en utilisant une colonne de grande qualité de séparation (par exemple QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) et purifiée en utilisant une unité centrifuge filtre avec un filtre en PVDF (0,1 um, Millipore, Bedford, MA) pour éliminer les particules dans le préparation de plasmide, qui peut obstruer pipettes d'injection au cours du processus d'injection. Les plasmides sont conservés à -20 ° C à une concentration d'environ 1 ug / ul dans un tampon de stockage d'ADN appropriés (par exemple tampon TE: Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). Immédiatement avant la microinjection, ADNc plasmidique sont dilués et mélangés à la concentration finale désirée dans un tampon TE ou H 2 O. Typiquement, 5-10 ng / ul du gène rapporteur est suffisante pour marquer les cellules injectées, et la concentration totale de l'ADNc à injecter ne doit pas dépasser 200 ng / ul car l'ADN est visqueux à des concentrations élevées et peuvent obstruer les pipettes d'injection. Un petit volume d'ADNc pour injection (ul 5-10) est préparé par des gouttes de mélange de solution sur la surface propre d'un petit morceau de Parafilm (côté sous le support papier). Mélanger les gouttes d'une solution ensemble par pipetage de haut en bas plusieurs fois avec un pipetor et éviter d'introduire des bulles d'air lors du mélange. En utilisant une pipette microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), transférer la solution d'ADNc dans un tube à hématocrite spécialement préparé (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Voir la section des matériaux pour des instructions sur la préparation des tubes à hématocrite (Tableau Matériaux). Placer le tube à hématocrite contenant la solution d'injection d'ADNc dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger le tube pendant 15-30 min à 10 000 g dans une microcentrifugeuse équipée d'un rotor à godets à angle fixe ou pivotant (Eppendorf), à température ambiante (20-24 ° C) aux particules de sédiments dans la solution d'ADNc qui peut bloquer le microinjection pipette. La solution d'injection d'ADNc peut être conservé à température ambiante pendant la séance d'injection. B. La fabrication des pipettes d'injection Pipettes en verre jetable microinjection sont disponibles commercialement (par exemple Femtotips, Eppendorf), qui sont pratiques mais coûteux (10 $ par microinjection pipette). Pipettes d'injection peuvent être fabriqués en laboratoire en utilisant un P-97 programmable extracteur Flaming pipette Brown (Sutter Instrument Company, Novato, CA) et filamenté, à parois minces tubes de verre borosilicate capillaire (instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride). Cette option est plus rentable et permet de contrôler la forme et la taille de la pipette de micro-injection. Un programme en deux étapes est utilisée pour tirer étroite embouts de pipettes microinjection. Depuis l'ouverture de pipettes microinjection est trop étroit pour examiner sous un microscope optique, la qualité des pipettes d'injection doivent être évalués directement par l'injection de quelques cellules avant que les paramètres du programme sont finalisés. Les paramètres suivants sont approximatifs pour les réglages de la chaleur, tirer, la vitesse et le temps: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Ces paramètres varient en fonction de différents lots de verre et par l'état du filament de chauffage dans l'extracteur, et doit être ajustée au besoin. Pour plus de détails, voir 5. Tirez plusieurs pipettes d'injection (2-5) par plat de neurones à injecter, en cas de dommages ou de problèmes lors de la séance d'injection. Pipettes d'injection Conserver dans un récipient couvert pour empêcher la poussière de pénétrer dans l'embout de la pipette de micro-injection. II. Microinjection intranucléaire tente »> Cette section détaille le processus de l'injection d'ADNc dans le noyau des neurones. Une microinjection de configuration de base comprend un contraste de phase inversée microscope (Nikon par exemple Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) de visualiser le processus, micromanipulateur (par exemple Eppendorf 5171) pour contrôler le mouvement de la pipette d'injection et une pression (par exemple Eppendorf FemtoJet Express) injecteur d'expulser la solution d'ADNc de la pipette. Raccordement de l'injecteur de pression pour le micromanipulateur permet la synchronisation de ces deux derniers processus au cours des injections. Autres facultative, mais fortement recommandée, les composants comprennent un système de surveillance vidéo montée (caméra CCD, Cohu Inc, San Diego, CA; noir et blanc du moniteur vidéo, Sony Corporation, Tokyo, Japon). Ce système n'est pas une exigence absolue pour les injections; Cependant, le moniteur noir et blanc offre un contraste élevé pour une meilleure visualisation du noyau cellulaire et offre une expérience de visualisation plus confortable pendant les séances d'injection de long. De plus, un ordinateur portable exécutant un logiciel d'exploitation d'un contrôleur à main peut être utilisée à semi- automatiser le processus d'injection (voir discussion pour plus de détails). Le moment idéal pour injecter de neurones CTB est de 3-6 heures après la dissociation. A ce stade, les cellules sont sphériques, bien attaché au fond du plat, et le noyau est nettement visible, sous un microscope à contraste de phase, comme un organite central rond avec une membrane noire, contenant un seul ou plusieurs nucléoles (figure 1A). Placez un plat de neurones dissociés sur le centre de la platine du microscope. Réglez la mise au point et optimiser l'optique à contraste de phase du microscope de sorte que le noyau des neurones sont clairement visibles. Pipeter 2 ul de solution d'ADNc préparé dans une pipette de microinjection utilisant une pipette microloader. Évitez élaboration solution proche de la partie inférieure du tube hématocrite, car cela pourrait réveiller les particules qui se sont installés pendant la centrifugation. Le filament de la microinjection pipettes devrait aider à l'élaboration solution à la pointe, mais si petites bulles d'air persistent, tapotez doucement le côté du verre pour les déloger. Insérez la pipette de micro-injection dans le support de l'injecteur capillaire pression, puis fixer le support à l'micromanipulateur. Le support est fixé à un angle de 45 °. Abaissez la pipette de micro-injection dans le plat. Comme la pipette entre le milieu de culture, un ménisque se forme qui affecte la réfraction de la lumière et réduit la qualité d'image des neurones. Pour pallier ce problème, la tourelle anneau de phase peut être légèrement décalée jusqu'à ce que le noyau des neurones sont clairement visibles à nouveau. Certains systèmes ont une pression d'injection "propre" fonction qui applique une pression maximale de l'air de la pipette de micro-injection pour une courte durée. Utilisez cette fonction pour effacer la pipette de débris avant de commencer et pendant les injections si la pointe apparaît bouché. Si du liquide dissipé n'est pas visible sur l'écran tout en utilisant cette fonction, le remplacer par une pipette d'injection neuf. Centre de la pipette de micro-injection dans le moniteur de visualisation et d'aligner la pointe à côté d'un neurone et dans le même plan focal que le nucléole. Réglez cette position inférieure de l'axe z limite sur le micromanipulateur. Cette position est la profondeur de la pipette de micro-injection se qualifieront pour les injections au cours. Maintenant la position de la pointe d'environ 30 um dessus de ce point afin de la pipette de microinjection efface le haut de neurones. Le "injecter" une mode de Eppendorf 5171 micromanipulateur peut être définie avec les paramètres suivants pour effectuer des injections intranucléaires. La fonction d'injecter est activée, tandis que la fonction empaler est laissé. Un chemin d'injection diagonale (le long du x et l'axe z) produit le moins de dommages aux cellules, et donc le mode axial doit être utilisé pour les injections. Une vitesse d'injection de 300 um / s est suffisant, et de synchroniser la montée en pression lorsque la pipette de micro-injection atteint l'ensemble axe z limite. L'injecteur de pression contrôle la quantité de solution d'ADNc injecté dans le noyau. Dans le mode d'injection «automatique», la livraison de l'ADN est contrôlée dans le temps et initiée par le micromanipulateur connecté. La pression d'injection (Pi) devrait être fixé entre 100 et 200 hectopascals (hPa; 1 hPa ~ 0.015 psi); des pressions d'injection plus élevée n'améliore pas le taux de réussite ou la qualité des injections et peut indiquer d'autres problèmes avec la taille de la pointe de micro-injection pipette ou de l'ADN pureté . Une durée d'injection (ti) de 0,3 s et une pression de compensation (Pc) de 30 hPa, ce qui fournit une pression positive constante pour éviter l'entrée de l'occlusion des particules du milieu de culture dans l'embout de la pipette, devrait être utilisé. Position du neurone à être injecté sous la pointe de la pipette de micro-injection en utilisant le contrôle du microscope XY de l'axe. Aligner l'extrémité de la pipette au-dessus du centre du noyau en se concentrant avant et en arrière entre tIl pointe et les nucléoles. Injecter le noyau en appuyant sur le bouton d'injecter (sur le micromanipulateur). Pour l'étape d'injection, le mouvement de la pipette de micro-injection et le déversement d'une solution d'ADNc sont contrôlés par le micromanipulateur. Il est difficile de confirmer succès injections intranucléaires à l'œil nu, mais l'injection de la solution de viscosité relativement faible d'ADNc (par rapport à l'environnement visqueux nucléaire), apparaît souvent comme un panache blanc à contraste de phase optique et peut être utilisé comme un indicateur de l'injection dans le noyau. Parfois, la pipette de micro-injection ne pénètre pas la membrane nucléaire et pousse simplement le noyau. Une tentative de deuxième injection à la même position peut conduire à une injection réussie d'ADN dans le noyau. Gonflement de la cellule est généralement un indice de l'injection cytoplasmique involontaire. En outre, gonflement significatif nucléaire n'est pas bien toléré par les neurones et entraîne généralement la mort cellulaire peu après, ainsi, la pression d'injection et la durée ne doit pas dépasser les valeurs suggérées. Continuer injectant des neurones en repositionnant la platine du microscope pour aligner le neurone suivant sous la pipette de micro-injection. Systématiquement naviguer dans le plat à injecter approximativement 50-100 noyaux avant de retourner le plat de neurones dans l'incubateur pour une nuit d'incubation. Réussir neurones injectés peuvent être identifiés le jour suivant par l'expression du gène rapporteur. III. Les résultats représentatifs Figure 1: cervical supérieur ganglionnaires (CTB) neurones. L'image en contraste de phase de la SCG neurones 3 heures après la dissociation (A). A ce stade, le noyau est nettement visible qui aide l'alignement de la pointe de pipette de microinjection. Le noyau apparaît au centre de neurones avec un seul (à gauche) ou plusieurs (à droite) nucléoles sombre. CTB neurones 16 heures suivant l'injection d'ADNc EGFP dans le noyau (B). Gauche, CTB neurones vue sous un éclairage en contraste de phase. A droite, l'image de l'épifluorescence mêmes neurones montrant l'injection réussie et résultant en une expression de l'EGFP neurone. Barre d'échelle blanc est de 20 um. Figure 2: cellules entières enregistrements des courants qui traversent hétérologue-exprimé couplés aux protéines G intérieurement rectifier K + (GIRK) chaînes de neurones SCG. GIRK courants (I GIRK) ont été évoqués par une rampe de tension 200 ms de -140 à 40 mV à partir d'un potentiel de maintien de -60 mV (en médaillon de A) après l'activation du endogènes α 2-adrénergiques par la norépinéphrine (NE, 10 uM) . Des traces superposées sont des enregistrements du même neurone et indiquer avant (noir) et après l'application des deux seuls NE (bleu) ou NE plus 10 mm Ba 2 + (rouge). Les lignes pointillées indiquent le niveau zéro de courant. Pour l'enregistrement, je GIRK, la solution externe contenue (en mm) 130 NaCl, 5,4 KCl, HEPES 10, 10 CaCl 2, MgCl 2 0,8, 15 de glucose, le saccharose 15, et 0,0003 TTX, ajusté à pH 7,4 avec NaOH. La solution d'enregistrement interne contenue (en mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, MgCl 2 2, 10 HEPES, 4 MgATP, et 0,3 Na 2 GTP, ajusté à pH 7,2 avec KOH. Le manque de courant provoquée par la rampe de tension en présence du NE dans les neurones SCG non-injecté (A) montre que les neurones SCG n'expriment pas les chaînes GIRK endogène. D'injection réussie d'ADNc codant pour une fonctionnelle plasmide GIRK canal 11 donne lieu à des courants importants pendant la rampe de tension lorsqu'ils sont exposés à NE (B, gauche). Les courants ont les caractéristiques typiques des courants à travers les canaux GIRK: activation par un agoniste des récepteurs aux protéines G couplées (NE), rectification entrante, et de bloquer des courants par le bloqueur des canaux GIRK putatif, Ba 2 + (B, oligo-rouge de droite). Les cercles vides et remplis représentent j'ai GIRK dans l'exploitation et courant crête, respectivement. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 2.