多巴胺的释放突触前货箱码头在个别的可视化与FFNs

使用这种方法在研究中报道的Gubernator 等人，科学 324（5933）。 1441-1444（2009） 。 1。急性纹状体切片准备准备急性纹状体片之前，必须氧气的人造脑脊液（ASCF）和冷却用冰前至少15分钟，大脑提取。保持学联冰冷和含氧在解剖。学联（毫米）：125氯化钠，2.5氯化钾，碳酸氢钠3月 26日，氯化钙2.4，硫酸镁1.3，KH 2 PO 4 0.3，葡萄糖10，HEPES 5，pH值7.3-7.4，290-295 mOsm。 杀头无需麻醉雄性小鼠。 从小鼠中提取的全脑，并安装使用Krazy ®胶水vibratome上vibratome托盘。脑提取和安装，必须在2分钟内完成。在这段时间内，一定要保持学联冰冷和含氧保持组织的健康。 切割厚度在250微米之间囟1.54 0.62 1冠状纹状体的脑切片。这样就可以削减到6个半片，用针将获得整整3片。 含氧学联在室温孵育探头负载前至少1小时的脑切片。片显示良好FFN511加载，并保持积极成像长达4小时后切片准备。 2。载入FFN511 准备FFN511装载解决方案（10μMFFN511学联），还准备在学联100μm的ADVASEP – 7。所有的解决方案应准备新鲜和含氧加载到片之前至少15分钟。 单独孵育FFN511 30分钟，在室温下加载溶液片。 然后删除约束孵化100μm的含氧ADVASEP – 7学联为30分钟，在室温下 2装入片外组织的染料。现在切片成像准备。 3。在大脑切片成像FFN511 FFN511成像切片是使用多光子激光扫描显微镜进行。我们使用的是一个草原终极多光子激光扫描显微镜（以前我们使用的Zeiss LSM 510 NLO多光子激光扫描显微镜和取得了一定的成效，与蔡司显微镜）。 将在录音室FFN511装片（RC – 27L，华纳）在1-2毫升，每分钟的流量和含氧学联superfuse。然后将切片上的尼龙绳铂金竖琴在实验过程中，尽量减少运动。为了进一步减少运动，让片，影像稳定之前至少10分钟，在会议厅内。 可视化和定位的10倍水浸泡的目标下的明亮的领域发光的背侧纹状体。 在这一地区的地点和位置的两极扭曲钨电极，如果执行刺激实验。理想的成像区域位于内300微米之间的刺激双极电极的两个小技巧。放置在视野的中心区域。 图片FFN511标记下一个63X（0.9 NA）的水浸泡紫外线目标纹状体终端。 FFN511是兴奋与麦大激光光谱物理和纹状体终端的最佳荧光，在760纳米，是通过一个带通滤波器（480-520纳米）。 75 × 75微米地区的利益，在512 × 512像素分辨率与12位格式拍摄的图像。为刺激脱色实验，以弥补Z轴转移，5-7图像的Z系列，相隔1微米在z平面，获得每个时间段。 4。 FFN511脱色 destained FFN511标签可以通过高浓度氯化钾（我们使用70毫米氯化钾），（+），安非他明类兴奋剂的硫酸盐（AMPH，20微米），或电刺激。在氯化钾脱色实验，当高的钾学联解决方案适用于脑片，FFN511在2分钟内标签destains。记录XYZ – T图像随着时间的推移跟踪FFN511脱色。下面介绍了电刺激依赖多巴胺终端脱色： 随着时间的推移跟踪FFN511脱色，XYZ – T的图像记录。为了确保最小的片运动（Z轴少于4微米）并没有漂白Z – Stack的激光，控制时间序列图像，应取得至少5分钟前刺激。否则，调整激光功率。 这些控制图像之后，继续XYZ – T成像，同时启动的刺激频率1，4或20赫兹。 1，4或20 Hz（300微秒× 1毫安）的刺激，适用于本地纹状体通过ISO – Flex的刺激，引发主8脉冲发生器使用双极电极（AMPI，耶路撒冷，以色列）隔离。为了尽量减少在发布网站的去极化的变化，我们已经使用了刺激协议应用循环伏安法确定的最大刺激强度的150％。 使用适当的软件成像分析。在我们的实验室中，我们使用图像J（韦恩Rosband，美国国立卫生研究院，洛克维尔，MD）和自定义编写的软件在IDL（研究系统，博尔德，CO）的量化与时间3 puncta荧光的变化。 Represenative结果图1显示FFN511加载到纹状体切片，现在已经完成。代表使用10倍和60倍的目标的图像如图1所示。多巴胺终端的选择性标签可以destained 20μM的安非他明。 图2显示了FFN511高氯化钾标签脱色。 图3所示的FFN511标签由当地的电刺激脱色。 图1 FFN511标签多巴胺终端，在现场的皮质-纹状体急性片（一）标记FFN511急性现场皮质纹状体切片。丰富的标签在纹状体（STR）的，稀疏的皮质标签（CTX），并没有标签胼胝体（CC）的。比例尺：100微米（二）由安非他明纹状体FFN511脱色。左侧面板：前安非他明类兴奋剂;右图：20μM的安非他明20分钟后。比例尺：10微米。 图2。FFN511高氯化钾标签脱色。 FFN511标签destained在2分钟70毫米氯化钾在学联的应用。比例尺：10μm的。 图3。FFN511纹状体标签的频率依赖性脱色。（一 ）在4赫兹的局部刺激导致脱色从终端。在t = 0开始的刺激。比例尺：5微米（二）FFN511脱色4赫兹的Ca 2 + -和频率依赖性。控制收到无刺激（153 puncta从3片）。氯化镉（200μM）的脱色未刺激控制（475 puncta从5片）相同。由一个单一的指数衰减函数和半衰期（T 1 / 2）每个刺激频率的脱色曲线拟合值计算τx 0.693（1赫兹：765 puncta从9片，4赫兹：410 puncta从7片， 20赫兹：6片）416 puncta。请参阅期间在纹状体脑片制备的胞外分泌FFN511脱色的双光子显微镜视频显微镜。