النظام الآلي للقياسات واحدة الإسفار جزيء من الجزيئات الحيوية سطح يجمد
Summary
نحن في هذه المقالة تصف كيف يمكننا الحصول على الحنق من آثار جزيئات الحمض النووي الفردية ثبتوا على السطح باستخدام المجهر الآلي مبائر المسح.
Abstract
مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) تم المجهري تستخدم على نطاق واسع لدراسة بنية وديناميكية الجزيئات البيولوجية ذات الاهتمام ، مثل الأحماض النووية والبروتينات. جزيء واحد الحنق (SM – الحنق) القياسات على جزيئات يجمد تصريح طويلة من الملاحظات من قبل النظام على نحو فعال على حد سواء حتى photobleach الأصباغ ، مما يؤدي إلى آثار في الوقت الذي يقدم تقريرا عن الديناميات الجزيئية البيولوجية مع طائفة واسعة من الجداول الزمنية من الألف إلى دقائق. لتسهيل اقتناء عدد كبير من التحليلات الإحصائية للآثار ، لا بد من آلية عملية وينبغي أن تكون البيئة عينة رقابة مشددة على مدار الزمن القياس بأكمله (~ 12 ساعة). ويتم إنجاز هذا باستخدام مجهر المسح الآلي مبائر التي تسمح للاستجواب الآلاف من الجزيئات واحدة بين عشية وضحاها ، وخلية ميكروفلويديك الذي يسمح للسيطرة على تبادل العازلة ، مع تقييد محتوى الاكسجين ويحافظ على درجة حرارة ثابتة طوال فترة القياس بأكملها. هنا نبين كيفية تجميع الجهاز ميكروفلويديك وكيفية تفعيل سطحه لتجميد الحمض النووي. ثم كيف لنا أن نفسر لإعداد عازلة لتحقيق أقصى قدر من صمود للضوء وعمرها fluorophores. أخيرا ، وتبين لنا الخطوات المتبعة في إعداد برنامج الإعداد لاقتناء الآلي من الوقت حل جزيء واحد من آثار الحنق جزيئات الحمض النووي.
Protocol
Discussion
على الرغم من أنه تم تحسين البروتوكول أعلاه لنظامنا معينة ومحددة لاختيار من الأصباغ (TMR وATTO647N) ، فإنه ليست بأي حال ثبت الأسلوب فقط. في الآونة الأخيرة ، وظهر نظام بديل الأكسجين الكسح التي تتكون من حمض protocatechuic (PCA) / protocatechuate 3 ،4 – دي أكسيجيناز (PCD) لزيادة صمود للضوء من الأصباغ معينة 4. وبالمثل ، يمكن استخدام الثلاثي دولة أخرى مثل quenchers المركابتويثانول – β (BME) بدلا من Trolox ، رغم أن هذه قد لا تدوم طويلا قمع وامض بعض الأصباغ ، في 5 Cy5 معينة.
على الرغم من الشلل عبر ألبومين البيوتين streptavidin – biotinylated المصل البقري (BSA) هو الخيار المفضل للدراسات الأحماض النووية ، هي مناسبة أفضل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) المغلفة السطحية للدراسات من البروتينات لأنها غير محددة يمنع التصاق 1. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفرعي حيود محدودة الحجم إلى الحويصلات تغليف جزيء حيوي من الاهتمام في الحالات التي يمكن أن تتأثر بها التفاعلات السطحية 6.
في هذه المقالة قد اعتدنا على إعداد مبائر مجهزة photodiodes الانهيار السيليكون للحصول على آثار كثافة مضان. هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع توتال الداخلية المجاهر الإسفار التأمل (TIRF) مجهزة بكاميرات CCD. بغض النظر عن استخدام المجهر ، SM – الحنق يمكن الابلاغ عن القرارات المكانية يقترب من انجستروم عندما يتم تصحيحها بشكل صحيح إشارة المانحة ومتقبل 7.
Acknowledgements
نشكر تشاندران Sabanayagam لمساعدته في تطوير النظام ، جوشوا إيديل للحصول على المشورة بشأن تصميم الجهاز ميكروفلويديك والموظفين في معهد رولاند في جامعة هارفارد لقطع الآلات من الإعداد. نعترف مناقشات مفيدة مع أعضاء مجموعة ميلر في معهد رولاند وفي جامعة بوسطن ، وأعضاء فريق T. ها 's في UIUC للحصول على معلومات مفيدة. أخيرا ، ونحن نقدر الدعم المالي من مؤسسة العلوم الوطنية (PHY – 0701207) والمعهد الوطني للصحة (GM075893).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | ||
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | ||
| Tubing | Diba Industries | |||
| Biotinylated BSA | Sigma | A8549 | ||
| BSA | Sigma | A9085 | ||
| Streptavidin | Thermo Scientific | 0021122 | ||
| Sylgard 184 Elastomer Kit | DowCorning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit | |
| Trolox | Aldrich | 238813 | ||
| Catalase | Sigma | C3155 | ||
| Glucose Oxidase | Sigma | G2133 | ||
| D-Glucose | Sigma | G7528 | ||
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
Riferimenti
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. . Article in preparation. , .
