可视化的单分子荧光显微镜下的DNA复制

执行单分子的复制实验之前，一些材料需要提前做好准备。 1。 DNA复制模板复制反应的底物是生物素标记，尾M13的滚动一圈，准备使用标准的分子生物学技术1,2。 材料：M13mp18单链DNA，生物素的尾巴寡核苷酸引物（5' -生物素- T的36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT – 3“），T7 DNA聚合酶，加 ​​热块，苯酚/异戊醇/氯仿加入10倍，超过TBS缓冲液（330牛尾巴寡，33纳米M13）的寡核苷酸，退火的生物素标记的尾巴寡核苷酸的M13。 加热至65 ° C在加热块的混合物。加热后，打开热封锁，并允许缓慢冷却，以正确的引物退火。 催芽M13的64纳米T7 DNA聚合酶和T7复制缓冲区含有dNTPs和MgCl 2的混合物。 孵育反应在37 ° 12分钟，并与100毫米EDTA淬火。 净化填充产品的DNA，酚/氯仿/异戊醇提取到TE缓冲液透析或其他合适的存储缓冲区，并确定DNA浓度（返回提取每个恢复催芽M13的任何残余的有机相）。 一个模板制备的迭代可以很容易地使纳摩尔浓度模板的几毫升，足够几百到成千上万的单分子实验。 2。官能盖玻片用于连接的DNA玻璃盖玻片，玻璃是先与氨基硅烷，然后再加以生物素化的聚乙二醇分子官能。这种涂层有助于减少和DNA复制蛋白的非特异性相互作用与表面1,3。 材料：盖玻片，染色罐，3 -氨丙基甲氧基PEG5k – NHS酯，生物素，PEG5k NHSester，丙酮，1M氢氧化钾，乙醇，烤箱，浴sonicator 彻底清洁玻片，放置在染色罐和灌装的罐子，用乙醇。超声30分钟，冲洗出来的罐子和填充用1 M KOH。超声30分钟重复洗。 第一官能反应，所有的水的痕迹需要被删除。填写的罐子，用丙酮和10分钟的超声。再次用丙酮冲洗罐。 准备的硅烷丙酮试剂的2％V / V解决方案。添加到染色罐，搅拌2分钟。这种反应夫妇烷氧基氨基硅烷在玻璃集团，留下了对未来的耦合步骤的反应胺。淬火的大量过剩与水的反应。 他们在30分钟的烤箱在110℃烘烤干燥的盖玻片。 准备一个50:1的甲氧基：在100毫米碳酸氢钠 3 pH值8.2生物素聚乙二醇的混合物。旨在为约0.2％W / V的生物素化的聚乙二醇。 吸取100μL，到干硅烷盖玻片和另一盖玻片上顶部的PEG混合物。其中包括一个玻璃盖玻片间隔将使分离的盖玻片。 在3小时的PEG解决方案孵育盖玻片，然后单独每对盖玻片，用清水洗净广泛。要注意保持官能盖玻片的一面朝上只有一次方将涂用PEG。 干在真空状态下的盖玻片和存储。至少一个月的表面保持稳定，使盖玻片数十可以在一个批次，并根据需要使用。 这些材料应提前，然后使用每个实验。要启动每单分子实验，开始组装流室。 3。流室准备这项实验是使用官能盖玻片，双面胶带，石英片和管构造一个简单的流室。一个流室，准备为每个单分子实验1,4。 材料：双面胶带，刀片，与孔管，快干环氧石英片，官能盖玻片（见上文），链解决方案（1毫克/毫升的PBS 25μL），油管，封闭液（20毫米三pH值7.5，2毫米EDTA，50毫米氯化钠，0.2 mg / mL的BSA，0.005％Tween – 20的） 首先在干燥器中放置封闭液20-25毫升，为后面的步骤中删除任何气泡。 采取的PEG -官能盖玻片，PBS稀释的链霉亲和解决方案的125个分布在表面。离开这个孵育20分钟，同时准备室的其他部位，使链霉亲和绑定表面biotins。 剪下一块双面ð磁带的石英片的大小相匹配。马克磁带上的油管用铅笔绘制孔，使流室的轮廓，可以在磁带上（1毫克/毫升）位置。 使周围的孔2毫米宽的矩形。这将作为流动通道，所以一定要管的入口和出口直边和周围留有余地。如果需要，多渠道或不同大小都可以使用。 沿着绘制的轮廓切割，直，洗净切块，以确保进入通道没有粘合剂突出。 清洁的石英彻底使用丙酮或乙醇删除从以前的流通池建设的粘合剂。 找到最佳通道纲要对齐，删除背胶的一面，并小心地将磁带上的石英片。要小心，以正确对齐磁带，入口和出口孔要保持畅通。 削减的进风口和流动池出口的管道长度。它有助于减少约30 °角管，使管会不按对腔底部的平面。放置在某种支持暂停不易附着在接下来的步骤流细胞管。 链霉菌涂层的盖玻片，用水彻底冲洗和干燥的压缩空气。请记住，只有一面是官能;要小心不要把盖玻片。取出磁带备份的另一边，并将其放置到盖玻片的石英片。 盖玻片上轻按推被困在胶粘剂任何空气。这将有助于避免气泡进入流道。 用环氧树脂密封室的两侧。插入石英和地方用环氧树脂密封的孔切管。这需要几分钟干。 干燥后，开始阻止通过一个管子拉一些脱气封闭液的表面。非常适合一个21号的针管内0.76毫米。冲洗几次，以去除气泡，并允许至少一个半小时的孵化室。 4。单分子复制实验 材料：编写流室，SYTOX橙，TIRF显微镜，532 nm激光，CCD摄像头，图像采集软件的计算机，滚环DNA底物，复制蛋白流动池已被封锁后，一切准备就绪后开始的单分子实验。 以流动细胞和它放在显微镜舞台上。保持阶段剪辑室的地方，并确保流道直沿Y轴定位。 将流动池出口管注射泵使用较大直径的连接管或针。入口放置在封闭液和注射器，在管中删除任何空气，回拉。一个出水口管轻轻一抖，将帮助被困在流动池清除任何空气气泡。 25日下午在1毫升封闭液稀释股DNA为模板。在中等流量室的DNA，让良好的表面覆盖的流入。 0.025毫升/分钟的30分钟，效果很好。基于多少DNA分子表面上每一批盖玻片，或有多少人所需的实验，这可以是多种多样的。 一旦DNA中，洗出多余的DNA，用封闭液。至少有200卷流细胞洗涤除去所有的游离DNA。 开始脱气复制缓冲区。对于的大肠杆菌大肠杆菌的复制实验，在37 ° C，以减少在激烈的流动腔泡沫的风险。 打开激光和摄像机。冷却CCD需要达到的温度才可以使用。 如果执行37 ° C实验，打开加热器。要确定的目标是在与流通池接触，否则将散热片后。 洗衣机和脱气后的反应可以有所准备。混合核苷酸，数码地面电视服务，并在复制缓冲区SYTOX。然后添加蛋白质，轻轻混匀。 反应混合物流入流通池。这种流动的速度，需要足够的伸展双链。对于一个宽2毫米，高100微米流道0.04 mL / min的作品。 允许混合物进入会议厅，并开始成像的时候。一个好的技巧是将视野通道一侧，并专注于不干胶材料。这将确保你聚焦表面附近。 调整激光功率，显微镜的重点和TIRF角度。保持低功耗，以避免任何染色的DNA photocleavage。几分钟取决于DNA的复制率在1-5帧/秒的收购。如果需要，重复，以获得更长的的复制轨迹或移动到一个新的领域看到更多的分子。 反应后的混合物几乎是空白，它是一个好主意，流更多的缓冲区YTOX看到其他领域的观点。以多个不同的复制分子形象提供processivity决心的统计资料。 5。代表性的成果积极复制分子很容易被视为增长染色DNA。在我们的实验中，流淌的M13基板时25给出了一个60X，125微米× 125的观点微米领域（图1）100-1000分子。执行复制实验中使用的大肠杆菌大肠杆菌复制体蛋白在37 ° C（详情请参阅材料），每5-50复制分子的视野。当量浓度的T7复制体，在基板上更有效地启动，我们观察到在一个领域复制分子的70％。这些条件会产生一个产品的密度如此之高，单个分子难以解决和分析，这样的T7的实验是在较低的蛋白浓度进行。 数据分析：要获得率数据，只需情节的DNA与时间的终点，并计算斜率（图2 ）。 processivity，确定总长度的DNA。这些数字都将需要转换为碱基对。在进行实验之前，你应该知道在适当的放大倍率的相机的像素大小。碱基的转换，简直是一个很好的估计基础上的DNA晶体的长度，2.9 BP /纳米转换。但是，层流不会完全伸展的DNA，因此应当由执行到一个已知长度的DNA，如48502 BPλDNA，用生物素标记的寡核苷酸，它附着到流通池和测量SYTOX染色长度的DNA长度校准复制实验所用的流量。确定的碱基对/像素数量将允许精确计算的复制率和processivities。以大量的图片和电影，将提供大量的产品分子，使密谋率和processivity分布（图2） 1。 图1：（从编号1）。）卡通的滚环复制检测。 （SA，链）。领先的链合成的延伸的尾部连接圈和表面。尾巴转换为双链DNA的滞后链聚合酶和层流捉襟见肘。 B）SYTOX Orange和532 nm激发的范例领域。小荧光点的系绳，非复制的基板。请注意产品的极端的长度和每场的产品（每个流动池包含5000等领域）的大量。 图2：（改编自文献1）。A，B）典型的复制分子Kymographs T7（A） 和 E 大肠杆菌 （二）实验。 C）a）和b）的分子端点轨迹绘制随时间变化。轨迹都配有线性回归获得复制率。所示的例子是99.4 BP s – 1和467.1 BP s – 1时。 D）复制产品的长度分布，配合单指数衰减，获得processivity：25.3 ± 1.7 KBP（T7），85.3 ± 6.1 KBP（大肠杆菌）。 E）的单分子轨道的速率分布，配合单高斯。方式：75.9 ± 4.8 BP s – 1时（T7），535.5 ± 39 BP s – 1时（ 大肠杆菌 ）。