Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi
Summary
Kendi arıtma genellikle gerekli bağışıklık hücre popülasyonlarının fonksiyonunu etkili bir şekilde incelenmesi. Kompleman tükenmesi, izolasyonu için yüksek saflıkta bağışıklık hücre popülasyonlarının hızlı ve ucuz bir tekniktir.
Abstract
Bağışıklık hücre popülasyonlarının arıtma genellikle kendilerine özgü işlevleri araştırmak için gereklidir. , Yüksek saflıkta hücre popülasyonlarının izolasyonu, özellikle real-time PCR ve mikroarray analizi gibi moleküler yaklaşımlar gerektirir. Yaygın olarak kullanılan arıtma stratejileri floresan aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), manyetik boncuk ayırma ve tamamlayacak tükenmesi içerir. Üç strateji, kompleman tükenmesi, hızlı, ucuz, hücreler ve yüksek bir hücre verimi nazik olmanın avantajları sunmaktadır. Kompleman sistemini aktive edildiğinde, hücre ölümü ile sonuçlanan hücre yüzeyinde gözenek oluşturan bir zar-saldırı kompleksinin oluşumu sonuçlanan bir proteolitik kaskad başlatmak plazma proteinlerine çok sayıda oluşur.<sup> 1</sup>. IgM ve IgG antikorları tarafından klasik yolu aktive olur ve ilk bakterilerin öldürülmesi için bir mekanizma olarak tarif edilmiştir. Nesil ile monoklonal antikorlar (mAb), kompleman kaskadını antijene spesifik bir şekilde herhangi bir hücreyi nüfus lyse kullanılabilir. Kompleman kaskadı hücreleri tükenmesi tamamlayıcı sabitleme antijen-spesifik antikorların ve başlangıç hücre popülasyonu tavşan tamamlayıcı eklenmesi ile elde edilir. Hücreler 37 ° C ve parçalanan hücreler, daha sonra iki tur yıkama kaldırılır, bir saat süreyle inkübe edilir. Kompleman fiksasyon için yüksek verimlilik ile MAb genellikle hedeflenen hücre popülasyonunun% 95-100 tüketir. Hedeflenen hücre popülasyonu için arıtma stratejisine bağlı olarak, tamamlayıcı tükenmesi hücre arıtma için ya da, daha sonra, bir sonraki yöntemi ile saflaştırılmış olabilir hücre popülasyonlarının da zenginleşmesi için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Hücre popülasyonlarının arıtma işlevlerin çalışması için gerekli olan ortak bir işlemdir. Burada antijen-spesifik antikorlar ve kompleman tükenmesi kullanarak hücre popülasyonlarının tüketen bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. Kompleman aktive antikor soyundan bir marker varsa, herhangi bir hücre popülasyonunun tükenmesine elde edilebilir. Burada Thy1 için mAb spesifik T hücrelerinin tükenmesi gösterdi, protein, aslında tüm T hücre popülasyonlarının dile getirdi. Biz,% 95 αβ T hücreleri üzerinde tükenmiş ve geri kalan splenositlerin% 68% 98 artmıştır. Bu düzeyde hücre saflık FACS ve manyetik boncuk ayrılması da dahil olmak üzere diğer arıtma stratejilerine benzer. Kompleman tükenmesi başlangıç hücre popülasyonu elde bir kez 1.5 saat yapılabilir hızlı bir tekniktir. Tamamlayıcı tükenmesi diğer bir avantajı, pahalı ekipman ve reaktifler gerektirmez, çünkü herhangi bir laboratuvar tekniği gerçekleştirebilirsiniz. Gerekli ekipman sadece büyük parçalarını, bir su banyosu ve bir santrifüj. Tavşan tamamlayıcı makul bir maliyetle çeşitli satıcılardan satın alınabilir (reaktiflerin tabloya bakınız) ve birçok mAb ATTC alınan ve maliyetleri kontrol etmek için yörede yetiştirilen olabilir. Buna karşılık, FACS altı rakamlar ve pahalı floresan etiketli mAb mal olacak hücre sıralama kapasitesine sahip bir akış sitometresinin gerektirir. Manyetik boncuk ayrılması orta fiyatlı, ama pahalıya mal olabilir bir mıknatıs ve manyetik boncuk, satın gerektirir. Buna ek olarak, bazı manyetik boncuk ayırma stratejileri de sütun satın alınmasını gerektirebilir.
Ana engel hücre tükenmesi için tamamlayıcı kullanımı için gerekli olan antijen özgüllüğü mAb aktive kompleman durumu. Insan, fare ve sıçan antikorlar tüm düzeltmek için tamamlayıcı kapasitesi olmasına rağmen, bazı isotypes diğerlerinden daha iyidir. Her üç türün IgM tamamlayıcı tespit son derece etkili olmasına rağmen IgG isotypes değişir. Böylece her mAb ilk etkinliğini belirlemek için bir pilot çalışmada test edilmelidir. Yüksek verimli değildir antikorlar için, iki tur tamamlayıcı tükenmesi kalan hücre popülasyonlarının canlılığı etkilemeden yapılabilir. Maliyet tasarrufu gibi, antikorlar optimal etkinliği için titre edilmelidir. Buna ek olarak, kullanılan antikorların arıtılmış olması gerekmez. Arındırmak için zor IgM antikorlar, özellikle uygun olduğu gibi etkin bir şekilde Hibridoma süpernatantlar ve asit sıvısı iş. Antikorlar gibi, tamamlayıcı bir pilot çalışmada titre şarttır. Konsantrasyonu çok yüksek hedefli olmayan hücre popülasyonlarının canlılığı kaybına neden olacaktır. Ayrıca önemli inkübasyon süresi 60 dakikayı aşmayacak şekilde.
Protokolde, antikor ve kompleman birlikte co-kuluçkaya yatmaktadır. Bununla birlikte, hücrelerin antikor ile 15-30 dakika etiketli ve kompleman eklenmeden önce yıkanmış olabilir. Bu stratejiyi kullanarak, yama ve kapaklama veya reseptör içselleştirilmesi, bazı proteinler oluşur, hücre yüzeyinde hücre antijen kaybını önlemek için buz üzerinde antikor inkubasyon gerçekleştirmek için emin olun. Yüksek verimli olmasına rağmen, diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında tükenmesi tamamlamak için büyük dezavantajı olumlu seçimi için kullanılan olamaz. Böylece hücre alt popülasyonlar elde etmek zordur. Örneğin, en iyi FACS tarafından yapılabilir foliküler B hücreleri, marjinal zon B hücreleri arındırmak için zor olurdu. Bu durumda, kompleman aktivasyonu sıralanmış olan hücrelerin sayısını azaltmak için T hücreleri tüketmek için kullanılabilir. Bu strateji, tasarruf hangi sıralama zamanı azaltmak ve hücrelerin daha az sert olurdu.
Özel hücre popülasyonlarının arıtma ortak bir gereklilik olduğu için bir dizi strateji geliştirilmiştir olmuştur. Tamamlayıcı tükenmesi stratejinin ana avantajları ekonomiklik, teknik kolaylık ve zaman tasarrufu.
Acknowledgements
Sreemanti Basu Şekil 1 için veri sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe AI069358 ve BloodCenter Araştırma Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
Riferimenti
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
