보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈
Summary
효과적으로 정화가 자주 필요한 면역 세포 집단의 기능을 연구합니다. 보완 고갈은 고순도와 면역 세포 인구의 격리를위한 신속하고 저렴한 방법입니다.
Abstract
면역 세포 집단의 정화는 종종 자신의 고유의 기능을 연구하기 위해 필요합니다. 이러한 실시간 PCR과 microarray 분석 등 특히, 분자 접근법에서 고순도로 세포 인구의 격리를 필요로합니다. 일반적으로 사용되는 정화 전략은 형광 활성 세포 분류 (외과), 마그네틱 비드 분리 및 보완 고갈을 포함합니다. 세 전략, 보완의 고갈은 빠르고 저렴, 세포가 높은 세포 수율에 부드러운되는 장점을 제공합니다. 보완 시스템이 활성화되면 세포 사망의 결과 세포 표면에 기공을 형성하는 멤브레인 – 공격 복잡한 형성에 culminating proteolytic 층계를 시작 플라즈마 단백질의 다수로 구성되어 있습니다<sup> 1</sup>. 고전 경로는 IgM과 IgG 항체에 의해 활성화되며 첫 살해 박테리아를위한 메커니즘으로 설명했다. 단클론 항체 (mAb)의 세대, 보완 층계는 항원에 특정한 방식으로 모든 세포 인구를 lyse하는 데 사용할 수 있습니다. 보완 층계에 의해 세포의 고갈은 보완의 고정 항원에 특정한 항체를 시작 셀 인구 토끼 보완의 추가에 의해 이루어진다. 세포 ° C와 lysed 세포 세척 후 두 라운드에 의해 제거 37 한 시간 동안 incubated 수 있습니다. 보완의 고정을위한 고효율 MAb은 일반적으로 타겟 세포 인구의 95-100%를 고갈. 대상 세포 인구를위한 정화 전략에 따라 보완 고갈은 세포 정화 또는 다음 추가 후속 방법으로 정화 수있는 세포 집단의 강화에 사용될 수 있습니다.
Protocol
Discussion
세포 인구의 정화는 기능의 연구에 필요한 일반적인 절차입니다. 여기 우리는 항원 – 항체 및 구체적인 보완 고갈을 사용하여 셀 인구 파괴의 신속하고 효과적인 방법을 설명합니다. 보완 – 활성화 항체가 혈통 특정 마커를 사용할 경우 모든 세포 인구의 고갈이 형성될 수 있습니다. 여기에 우리가 Thy1에 대한 mAb를 사용하여 특정 T 세포의 고갈을 시연, 단백질은 본질적으로 모든 T 세포 집단에 의해 표시됩니다. 우리는 αβ T 세포의 95 % 이상 고갈 나머지 splenocytes는 68%에서 98 %로 증가했다. 세포 순결의이 수준은 외과와 자석 구슬 분리 등 다른 정화 전략과 비슷합니다. 보완 고갈이 시작 셀 인구가 획득되면 1.5 시간에 수행할 수있는 빠른 방법입니다. 보완 고갈의 또 다른 장점은 고가의 장비와 시약을 필요로하지 않기 때문에 모든 실험실이 기법을 수행할 수있다는 것입니다. 필요한 장비의 유일한 주요 작품은 물 목욕과 원심 분리기입니다. 토끼 보완은 저렴한 비용으로 다양한 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다 (시약의 표 참조) 많은 mAb는 ATTC에서 구입하여 비용을 관리하는 로컬 성장하실 수 있습니다. 반면, 외과는 여섯 숫자와 비싼 찬란 태그 mAb의 비용 셀 정렬 용량 흐름 cytometer이 필요합니다. 마그네틱 비드 분리 알맞게 가격이지만, 치명타가 될 수 있습니다 자석과 자석 구슬의 구입이 필요합니다. 또한, 일부 자기 비드 분리 전략은 또한 컬럼의 구입이 필요합니다.
세포 고갈에 대한 보완의 사용에 가장 큰 걸림돌이 필요한 항원 특이성과 mAb를 활성화 보완의 가용성이다. 인간, 마우스 및 쥐 항체가 모두 보완 문제를 해결하는 능력을 가지고 있지만, 일부 isotypes 다른보다됩니다. 세 종 IgM은 보완을 고치에서 매우 효과이지만, IgG의 isotypes이 다릅니다. 따라서 모든 mAb 먼저 그 효과를 확인하기 위해 파일럿 연구에서 테스트해야합니다. 고효율되지 않은 항체 들어, 보완 고갈의 두 라운드가 남아있는 세포 집단의 생존에 영향을주지 않고 수행할 수 있습니다. 비용 절감으로 항체는 최적의 효과에 대한 titrated해야합니다. 또한, 사용되는 항체는 정화가 필요가 없습니다. 정화 어렵습니다 IgM 항체, 특히 편리합니다 마찬가지로 효과적으로 하이 브리 도마 supernatants 및 복수 유체 작업. 항체와 마찬가지로 그것은 보완이 파일럿 연구에서 titrated하는 것이 필수적입니다. 농도의 너무 높은가 아닌 타겟 세포 인구의 생존 능력의 손실을 초래합니다. 또한 중요 부화 시간이 60 분 초과하지 않는다는 것입니다.
우리의 프로토콜에서는, 우리는 함께 항체와 보완을 공동 품어. 그러나, 세포는 15-30분에 대한 항체로 분류 사전 보완을 추가로 씻어 수 있습니다. 이 전략을 사용하는 경우와 같은 패치 및 상한 또는 수용체 국제화에 의해 일부 단백질과 발생, 세포 표면에있는 세포 항원의 손실을 방지하기 위해 얼음에 항체 incubations을 수행할 수 있는지 확인하십시오. 고효율이지만, 다른 방법에 비해 소모를 보완하기 위해 주요 단점은 그것이 긍정적인 선택에 사용할 수 없다는 것입니다. 그러므로 그것은 세포의 subpopulations를 얻을 어렵습니다. 예를 들어, 최고의 외과에 의해 수행 될 follicular의 B 세포에서 한계 영역 B 세포를 정화하기 어려운 것입니다. 이 상황에서, 보완 정품 인증이 정렬되는 세포의 수를 줄이기 위해 T 세포를 고갈하는 데 사용할 수 있습니다. 이 전략은 비용을 절감하는 것이있는, 정렬 시간을 줄일 것이며, 세포에 덜 거칠 것입니다.
특정 세포 집단의 정화는 일반적인 요구 사항이기 때문에 전략의 번호가 개발되었습니다. 보완 고갈 전략의 주요 장점은 경제성, 기술적 단순 및 시간 절감하고 있습니다.
Acknowledgements
나는 그림 1의 데이터를 제공 Sreemanti Basu 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 부여 AI069358 및 BloodCenter 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
Riferimenti
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
