L'esaurimento delle popolazioni di cellule specifiche da deplezione del complemento
Summary
Per studiare in modo efficace la funzione di popolazioni di cellule immunitarie loro purificazione è spesso richiesto. Esaurimento complemento è una tecnica veloce ed economico per l'isolamento di popolazioni di cellule immunitarie con elevata purezza.
Abstract
La purificazione di popolazioni di cellule immunitarie è spesso necessaria per poter studiare le loro funzioni uniche. In particolare, gli approcci molecolari come la PCR in tempo reale e analisi microarray richiedono l'isolamento di popolazioni di cellule con elevata purezza. Strategie di purificazione comunemente usati includono fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS), separazione magnetica tallone e la deplezione del complemento. Delle tre strategie, l'esaurimento complemento offre i vantaggi di essere veloce, poco costoso, delicato sulle cellule e una resa cellula alto. Il sistema del complemento è composto da un gran numero di proteine del plasma che, quando attivato avviare una cascata proteolitica si conclude con la formazione di una membrana attacco complesso che forma un poro sulla superficie cellulare con conseguente morte cellulare<sup> 1</sup>. La via classica è attivata da anticorpi IgM ed IgG ed è stato descritto come un meccanismo per uccidere i batteri. Con la generazione di anticorpi monoclonali (mAb), la cascata del complemento può essere usato per lisare qualsiasi popolazione di cellule in un antigene specifico modo. Deplezione delle cellule dalla cascata del complemento si ottiene con l'aggiunta del complemento di fissaggio antigene-anticorpi specifici e complemento di coniglio alla popolazione di cellule di partenza. Le cellule vengono incubate per un'ora a 37 ° C e le cellule lisate vengono successivamente rimossi con due turni di lavaggio. Mab ad alta efficienza per la fissazione del complemento tipicamente esaurire 95-100% della popolazione di cellule bersaglio. A seconda della strategia di depurazione per la popolazione di cellule bersaglio, l'esaurimento complemento può essere usato per la purificazione delle cellule o per l'arricchimento di popolazioni di cellule che poi può essere ulteriormente purificato con un metodo successivo.
Protocol
Discussion
La purificazione di popolazioni cellulari è una procedura comune richiesto per lo studio delle loro funzioni. Qui si descrive un metodo veloce ed efficace riducono popolazioni di cellule con antigene-anticorpi specifici e l'esaurimento del complemento. L'esaurimento di ogni popolazione di cellule può essere raggiunto se un complemento, l'attivazione di anticorpi è disponibile a un marcatore specifico lignaggio. Qui abbiamo dimostrato l'esaurimento delle cellule T utilizzando un mAb specifici per Thy1, una proteina espressa da tutti essenzialmente popolazioni cellulari T. Noi impoverito oltre il 95% delle cellule T αβ splenociti e le rimanenti sono stati aumentati dal 68% al 98%. Questo livello di purezza cella è simile ad altre strategie di purificazione compresi FACS e magnetici separazione tallone. Esaurimento complemento è una tecnica veloce che può essere eseguita in 1,5 ore una volta che la popolazione cellulare di partenza è ottenuto. Un altro vantaggio di esaurimento complemento è che ogni laboratorio può eseguire la tecnica in quanto non richiede costose attrezzature e reagenti. L'unica elementi principali degli strumenti richiesti sono un bagno d'acqua e una centrifuga. Complemento di coniglio può essere acquistato da una varietà di fornitori a costi ragionevoli (vedi tabella dei reagenti) e molti mAb possono essere acquistati presso ATTC e cresciuto a livello locale per controllare i costi. Al contrario, FACS richiede un citofluorimetro con capacità delle cellule di smistamento che costerà in sei cifre e costoso fluorescente tag mAb. Separazione magnetica tallone è un prezzo abbordabile, ma richiede l'acquisto di un magnete e sfere magnetiche che possono essere costosi. Inoltre, alcune strategie di separazione magnetica tallone richiedono anche l'acquisto di colonne.
Il principale ostacolo per l'utilizzo del complemento per deplezione delle cellule è la disponibilità di complemento attivare mAb con la specificità dell'antigene necessario. Sebbene anticorpi umani, topi e ratti hanno tutti la capacità di fissare complemento, alcuni isotipi sono migliori di altri. Anche se IgM da tutte e tre le specie è altamente efficace a fissare il complemento isotipi IgG variare. Così ogni mAb deve prima essere testato in uno studio pilota per determinare la sua efficacia. Per gli anticorpi che non sono molto efficienti, due turni di esaurimento complemento può essere effettuata senza compromettere la vitalità delle popolazioni di cellule rimanenti. Come un risparmio sui costi, gli anticorpi dovrebbero essere titolati per un'efficacia ottimale. Inoltre, gli anticorpi utilizzati non hanno bisogno di essere purificati. Surnatanti di ibridomi e liquido ascitico lavoro in modo altrettanto efficace, il che è particolarmente conveniente per gli anticorpi IgM, che sono difficili da purificare. Come per gli anticorpi, è indispensabile che il complemento di essere titolati in uno studio pilota. Un troppo elevato di concentrazione comporterà la perdita di vitalità di non mirato popolazioni cellulari. Altrettanto importante è che il tempo di incubazione non superi i 60 minuti.
Nel nostro protocollo, abbiamo co-incubare l'anticorpo e il complemento insieme. Tuttavia, le cellule possono essere etichettati con anticorpi per 15-30 minuti e lavati prima l'aggiunta del complemento. Quando si usa questa strategia, assicurarsi di eseguire le incubazioni anticorpi sul ghiaccio per prevenire la perdita dell'antigene cellule sulla superficie della cellula, come accade con alcune proteine di patch e tappatura o internalizzazione recettoriale. Anche se ad alta efficienza, l'inconveniente principale per completare l'esaurimento rispetto ad altri metodi è che non può essere utilizzato per la selezione positiva. Così è difficile ottenere le sottopopolazioni di cellule. Per esempio, sarebbe difficile per purificare le cellule B della zona marginale a partire da cellule B follicolari, che sarebbe meglio essere fatto da FACS. In questa situazione, l'attivazione del complemento potrebbero essere utilizzati per deplezione delle cellule T per ridurre il numero di celle da ordinare. Questa strategia riduce il tempo per specie, che permetterebbe di risparmiare denaro e sarebbe meno dura sulle cellule.
Dal momento che la purificazione delle popolazioni di cellule specifiche è un requisito comune una serie di strategie sono state sviluppate. I vantaggi principali della strategia di riduzione del complemento sono la sua economicità, semplicità tecnica e risparmio di tempo.
Acknowledgements
Vorrei ringraziare Sreemanti Basu di fornire i dati di Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH concedere AI069358 e la Fondazione di Ricerca BloodCenter.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
Riferimenti
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
