El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento
Summary
Para estudiar con eficacia la función de las poblaciones de células inmunes a menudo es la purificación necesaria. El agotamiento del complemento es una técnica rápida y barata para el aislamiento de las poblaciones de células inmunes de alta pureza.
Abstract
La purificación de las poblaciones de células inmunes se requiere a menudo con el fin de estudiar sus funciones exclusivas. En determinados enfoques, molecular como PCR en tiempo real y análisis de microarrays de requerir el aislamiento de las poblaciones de células con alta pureza. Comúnmente utilizado estrategias de purificación son fluorescentes clasificación de células activadas (FACS), la separación de esferas magnéticas y el agotamiento del complemento. De las tres estrategias, el agotamiento del complemento ofrece la ventaja de ser rápido, barato, suave con las células y una producción de células de alta. El sistema del complemento se compone de un gran número de proteínas plasmáticas que cuando se activa iniciar una cascada proteolítica que culminó en la formación de un complejo de la membrana de ataque que forma un poro en la superficie de una célula que resulta en la muerte celular<sup> 1</sup>. La vía clásica es activada por los anticuerpos IgM e IgG y fue descrita por primera vez como un mecanismo para matar las bacterias. Con la generación de anticuerpos monoclonales (mAb), la cascada del complemento se puede utilizar para lisar cualquier población de células de una forma antígeno-específica. Agotamiento de las células de la cascada del complemento se logra mediante la adición de antígeno de fijación del complemento específico de los anticuerpos y complemento de conejo a la población de células de partida. Las células se incubaron durante una hora a 37 ° C y las células lisadas se retira posteriormente por dos rondas de lavado. MAb con una alta eficiencia para la fijación del complemento suele agotar el 95-100% de la población de células específicas. Dependiendo de la estrategia de purificación de la población de células específicas, el agotamiento del complemento se puede utilizar para la purificación de células o para el enriquecimiento de las poblaciones de células que luego pueden ser purificados por el método siguiente.
Protocol
Discussion
La purificación de las poblaciones de células es un procedimiento común necesarios para el estudio de sus funciones. Aquí se describe un método rápido y eficaz de agotar las poblaciones de células con antígeno de los anticuerpos específicos y el agotamiento del complemento. El agotamiento de cualquier población de células se puede lograr si un anticuerpo complemento de activación está disponible para un marcador específico de linaje. Aquí hemos demostrado el agotamiento de las células T con un mAb específico para Thy1, una proteína expresada por prácticamente todas las poblaciones de células T. Hemos agotado más del 95% de las células T αβ y los esplenocitos restantes se incrementaron del 68% al 98%. Este nivel de pureza de las células es similar a otras estrategias de purificación y separación entre FACS cuentas magnéticas. El agotamiento del complemento es una técnica rápida que se pueden realizar en 1,5 horas una vez que la población de células de partida se obtiene. Otra ventaja del agotamiento del complemento es que cualquier laboratorio puede realizar la técnica, ya que no requieren equipos costosos y reactivos. Las únicas piezas principales del equipo requerido es un baño de agua y una centrífuga. Complemento de conejo se pueden comprar en una variedad de proveedores a un costo razonable (véase la tabla de reactivos) y muchos otros AcM se pueden comprar de ATTC y de origen local para controlar los costos. Por el contrario, FACS requiere un citómetro de flujo con una capacidad de clasificación de células que tendrá un costo de seis figuras y caras marcado con fluorescencia mAb. Separación de esferas magnéticas es de precio moderado, pero requiere la compra de un imán y las bolas magnéticas, que pueden ser costosos. Además, algunas estrategias de separación con bolas magnéticas también requieren la compra de las columnas.
El principal obstáculo para el uso del complemento para el agotamiento de las células es la disponibilidad de complementar la activación de AcMo con especificidad de antígeno requerida. Aunque los anticuerpos humanos, ratones y ratas tienen la capacidad de fijar el complemento, algunos isotipos son mejores que otros. A pesar de IgM de las tres especies es muy eficaz para la fijación de complemento de los isotipos IgG varían. Así, cada AcM primero debe ser probado en un estudio piloto para determinar su eficacia. Los anticuerpos que no son muy eficientes, dos rondas de agotamiento de complemento se puede realizar sin afectar la viabilidad de las poblaciones de células restantes. Como un ahorro de costes, los anticuerpos se debe ajustar para una eficacia óptima. Además, los anticuerpos utilizados no necesita ser purificado. Hibridoma sobrenadantes y el trabajo ascitis fluido con la misma eficacia, que es particularmente conveniente para los anticuerpos IgM, que son difíciles de purificar. Al igual que con los anticuerpos, es imprescindible que el complemento de ser valorados en un estudio piloto. Una alta concentración de demasiado resultará en la pérdida de la viabilidad de las poblaciones de células no específicas. También es importante que el tiempo de incubación no exceda de 60 minutos.
En nuestro protocolo, que co-incubar el anticuerpo y el complemento del conjunto. Sin embargo, las células pueden ser etiquetados con anticuerpos durante 15-30 minutos y se lava antes de la adición del complemento. Cuando se utiliza esta estrategia, asegúrese de llevar a cabo las incubaciones de anticuerpos en el hielo para evitar la pérdida del antígeno de células en la superficie celular, como ocurre con algunas de las proteínas mediante parches y la limitación o la internalización del receptor. Aunque altamente eficiente, el principal inconveniente para complementar el agotamiento, en comparación con otros métodos es que no se puede utilizar para la selección positiva. Por lo tanto, es difícil obtener las subpoblaciones de células. Por ejemplo, sería difícil de purificar las células B de zona marginal de células B folicular, que se podría realizar por FACS. En esta situación, la activación del complemento se podría utilizar la depleción de células T para reducir el número de células se van a ordenar. Esta estrategia reduciría el tiempo de clase, lo que ahorraría dinero y podría no ser tan duro en las células.
Desde la purificación de poblaciones celulares específicas es un requisito común una serie de estrategias se han desarrollado. Las principales ventajas de la estrategia de reducción del complemento son su accesibilidad, simplicidad técnica y ahorro de tiempo.
Acknowledgements
Me gustaría dar las gracias a Sreemanti Basu de proporcionar los datos de la Figura 1. Este trabajo fue apoyado en parte por subvención NIH AI069358 y la Fundación de Investigación BloodCenter.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
Riferimenti
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
