Истощение конкретные клеточные популяции путем дополнения Истощение

Очистка клеточных популяций распространенная процедура, необходимые для изучения их функций. Здесь мы опишем быстрый и эффективный метод истощения клеточных популяций использованием антиген-специфических антител и дополнения истощения. Истощение любой популяции клеток могут быть достигнуты, если комплемент-активации антител доступна для линии специфическим маркером. Здесь мы показали истощение Т клеток с помощью МКА, специфичные для Thy1, белок, выраженных по существу, все Т клеточные популяции. Мы обедненного более 95% αβ Т-клеток и оставшиеся спленоцитов были увеличены с 68% до 98%. Этот уровень клеточного чистоты похож на другие стратегии, в том числе очистка FACS и магнитные бусины разделения. Дополнение истощение быстрый метод, который может быть выполнен в 1,5 часов после начала клеточной популяции получается. Еще одно преимущество дополнением истощения в том, что каждая лаборатория может выполнять технику, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Только основные части оборудования, необходимого являются водяной бане и центрифуги. Кролик дополнение можно приобрести у различных производителей по разумным ценам (см. таблицу реагентов) и многие мАт можно приобрести у ATTC и выращенного для управления затратами. В отличие от этого, FACS требует потока цитометр с соты сортировки, которая будет стоить в шесть цифр и дорогих флуоресцентно меткой МАБ. Магнитный шарик разделение умеренным ценам, но требует покупки магнита и магнитных бус, который может быть дорогостоящим. Кроме того, некоторые магнитные бусины стратегии разделения также требуют покупки колонок.

Основным камнем преткновения для использования дополнением для сотовых истощения является наличие комплемента активации МАБ с антигенной специфичности требуется. Хотя человека, мыши и крысы антител у всех есть возможность исправить дополнением, некоторые изотипов лучше, чем другие. Хотя IgM из всех трех видов является весьма эффективным при фиксации дополнением IgG изотипов меняться. Таким образом, каждый МКА должны быть сначала протестированы в рамках пилотного исследования с целью определения его эффективности. Для антитела, которые не являются высокоэффективными, два раунда дополнением истощения могут быть выполнены без ущерба для жизнеспособности оставшихся клеточных популяций. Как экономии средств, антитела следует титровать для оптимальной эффективности. Кроме того, антитела использоваться не должны быть очищены. Гибридома супернатанты и асцит жидкости работать так же эффективно, что особенно удобно для IgM антитела, которые трудно очистить. Как и антитела, крайне важно, чтобы дополнять титровать в экспериментальном исследовании. Слишком высокой концентрации может привести к потере жизнеспособности нецелевых клеточных популяций. Также важным является то, что инкубационный период не превышает 60 минут.

В нашем протокол, мы сотрудничаем инкубировать антител и дополнять друг с другом. Тем не менее, клетки могут быть помечены с антителами в течение 15-30 минут и промывают до того комплемента. При использовании этой стратегии, убедитесь, что для выполнения антител инкубации на льду, чтобы предотвратить потерю ячейки антигеном на поверхности клетки, как это происходит с некоторыми белков исправлений и укупорки или интернализация рецепторов. Хотя высокоэффективным, главный недостаток в дополнение к истощению, по сравнению с другими методами является то, что она не может быть использована для положительного отбора. Таким образом, трудно получить субпопуляций клеток. Например, было бы трудно очистить маргинальной зоне В-клеток фолликулярного В-клеток, которые лучше всего сделать, FACS. В этой ситуации, активации комплемента могут быть использованы для Т-клеток, разрушающих уменьшить количество клеток быть отсортированы. Эта стратегия позволит снизить рода времени, что позволит сэкономить деньги и будут менее суровыми клеток.

После очистки конкретных клеточных популяций является общим требованием ряд стратегий были разработаны. Основные преимущества стратегии истощения дополнением являются его доступность, техническая простота и экономия времени.