דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים
Summary
כדי ללמוד ביעילות את הפונקציה של אוכלוסיות תאים חיסוניים טיהור שלהם נדרש לעתים קרובות. דלדול משלים היא טכניקה מהירה וזולה עבור בידוד של אוכלוסיות תאים חיסוניים עם טוהר גבוהה.
Abstract
טיהור של אוכלוסיות תאים חיסוניים נדרש לעתים קרובות כדי ללמוד פונקציות הייחודיים שלהם. ב, גישות מסוים מולקולרית כגון בזמן אמת PCR וניתוח microarray דורשים בידוד של אוכלוסיות תאים עם טוהר גבוהה. אסטרטגיות טיהור נפוצים כוללים תא פלורסנט מיון מופעל (FACS), הפרדה חרוז מגנטי דלדול משלימים. מבין שלוש אסטרטגיות, דלדול משלימים מציע את היתרונות של להיות מהר, לא יקר, עדין על תאים תא תשואה גבוהה. המערכת השלמה מורכבת ממספר רב של חלבונים פלזמה שכאשר מופעל ליזום מפל proteolytic שהגיעה לשיאה היווצרות של מורכבות קרום התקף המהווה הנקבוביות על פני שטח התא והתוצאה היא מוות של תאים<sup> 1</sup>. מסלול קלאסי מופעל על ידי נוגדנים IgM ו IgG ו תוארה לראשונה כמנגנון להרוג חיידקים. עם הדור של נוגדנים חד שבטיים (מב), מפל משלימים שניתן להשתמש בהם כדי lyse כל האוכלוסייה התא באופן אנטיגן ספציפי. דלדול של תאים על ידי מפל השלמה מושגת על ידי תוספת של תיקון משלימים אנטיגן ספציפי נוגדנים ומשלימים ארנב לאוכלוסייה תא ההתחלה. התאים מודגרת למשך שעה אחת בכל 37 ° C ו התאים lysed יוסרו לאחר מכן על ידי שני סבבים של כביסה. מב עם יעילות גבוהה עבור קיבוע משלים בדרך כלל לרוקן 95-100% מהאוכלוסייה תא ממוקד. בהתאם לאסטרטגיה טיהור לאוכלוסייה תא ממוקד, דלדול משלימים ניתן להשתמש לטיהור התא או להעשרה של אוכלוסיות תאים כי אז יכול להיות מטוהרים נוסף בשיטה הבאים.
Protocol
Discussion
טיהור של אוכלוסיות תאים היא הליך שכיח נדרש ללמוד את תפקידם. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה של depleting אוכלוסיות תאים באמצעות אנטיגן ספציפי לערמונית נוגדנים דלדול משלימים. דלדול האוכלוסייה בכל תא ניתן להשיג אם נוגדן משלימים-הפעלת זמין סמן מסוים בשושלת. כאן אנו הדגימו את דלדול של תאים T באמצעות ספציפי עבור MAB Thy1, חלבון לידי ביטוי בעצם כל אוכלוסיות תאים טי. אנחנו מתרוקנים מעל 95% של תאים T αβ ואת splenocytes הנותרים עלה מ% 68 ל% 98. רמה זו של תא טוהר דומה אסטרטגיות טיהור אחרים, כולל FACS והפרדה חרוז מגנטי. דלדול משלים היא טכניקה מהירה שניתן לבצע ב 1.5 שעות פעם את האוכלוסייה התא החל מתקבל. יתרון נוסף של דלדול משלימים זה במעבדה כל יכול לבצע את הטכניקה, כי היא אינה דורשת ציוד יקר ריאגנטים. רק החלקים העיקריים של הציוד הנדרש הם אמבט מים צנטריפוגות. משלימים הארנב ניתן לרכוש ממגוון רחב של ספקים במחיר סביר (ראה טבלה של ריאגנטים) ו מב רבים ניתן לרכוש ATTC גדל באופן מקומי כדי לשלוט בעלויות. לעומת זאת, FACS דורש cytometer לזרום עם קיבולת מיון התא יעלה בששת דמויות MAB מתויג fluorescently יקר. הפרדה חרוז מגנטי במחיר בינוני, אך דורש רכישת מגנט, חרוזים מגנטיים, אשר יכול להיות יקר. בנוסף, כמה אסטרטגיות מגנטי ההפרדה חרוז גם דורשים רכישה של עמודות.
אבן הנגף העיקרית לשימוש משלימים עבור דלדול התא הוא הזמינות של השלמה עם הפעלת MAB סגוליות את האנטיגן הנדרשת. למרות נוגדנים אנושיים עכבר חולדה כל יש את היכולת לתקן משלימים, isotypes כמה טובים יותר מאחרים. למרות IgM מכל שלושה מינים הוא יעיל מאוד בתיקון להשלים את isotypes IgG להשתנות. כך מב כל חייב להיות הראשון נבדק במחקר ניסיוני כדי לקבוע את יעילותו. עבור נוגדנים שאינם היעילה ביותר, שני סבבים של דלדול משלימים ניתן לבצע מבלי להשפיע על הכדאיות של אוכלוסיות תאים הנותרים. כמו חיסכון בעלויות, נוגדנים יש טיטרציה עבור יעילות אופטימלית. בנוסף, נוגדנים בשימוש לא צריכים להיות מטוהרים. Hybridoma supernatants ו מיימת עבודה נוזל בדיוק כמו יעילה, אשר נוח במיוחד עבור נוגדנים IgM, אשר קשה לטהר. כמו עם הנוגדנים, קיים הכרח כי המשלים להיות טיטרציה במחקר פיילוט. ריכוז גבוה מדי תגרום לאובדן של הכדאיות של הלא ממוקד אוכלוסיות תאים. חשוב גם הוא כי זמן דגירה אינו עולה על 60 דקות.
בפרוטוקול שלנו, אנחנו עמיתים דגירה הנוגדנים ואת משלימים ביחד. עם זאת, התאים יכולים להיות מתויג עם נוגדן עבור 15-30 דקות, לשטוף לפני תוספת של השלמה. כאשר משתמשים באסטרטגיה זו, הקפד לבצע את incubations נוגדן על הקרח כדי למנוע אובדן של האנטיגן התא על פני התא, כפי שקורה עם חלבונים מסוימים על ידי תיקון ו מכסת או הפנמה הקולטן. למרות היעילה ביותר, החיסרון העיקרי כדי להשלים את דלדול בהשוואה לשיטות אחרות היא שזה לא יכול לשמש סלקציה חיובית. לכן קשה להשיג subpopulations של תאים. לדוגמה, קשה יהיה לטהר את שולי B אזור תאים תאים B פוליקולרית, אשר היה הטוב ביותר לעשות זאת על ידי FACS. במצב זה, הפעלת המשלים יכול לשמש כדי לרוקן בתאי T כדי להפחית את מספר התאים להיות מיון. אסטרטגיה זו תפחית את הזמן למיין, אשר היה לחסוך כסף יהיה פחות קשות על התאים.
מאז הטיהור של אוכלוסיות תאים ספציפיים היא דרישה נפוצה מספר אסטרטגיות פותחו. היתרונות העיקריים של האסטרטגיה דלדול משלימים הם, בפשטות שלה affordability טכני חיסכון בזמן.
Acknowledgements
אני רוצה להודות Sreemanti Basu לספק את הנתונים בתרשים 1. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענק AI069358 וקרן מחקר BloodCenter.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
Riferimenti
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
