Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l'épuisement Complément
Summary
Pour bien étudier la fonction des populations de cellules immunitaires leur purification est souvent nécessaire. L'épuisement du complément est une technique rapide et peu coûteuse pour l'isolement des populations de cellules immunitaires avec une grande pureté.
Abstract
La purification des populations de cellules immunitaires est souvent nécessaire afin d'étudier leurs fonctions uniques. En particulier, les approches moléculaires comme la PCR en temps réel et de l'analyse par microréseau nécessite l'isolement des populations de cellules avec une grande pureté. Stratégies de purification couramment utilisés comprennent le tri de cellules fluorescentes (FACS), séparation magnétique et l'épuisement des billes complément. Parmi les trois stratégies, l'épuisement de compléter offre l'avantage d'être rapide, peu coûteuse, doux sur les cellules et un rendement élevé de cellules. Le système du complément est composé d'un grand nombre de protéines plasmatiques qui lorsqu'il est activé initier une cascade protéolytique aboutissant à la formation d'un complexe membranaire d'attaque qui forme un pore sur une surface cellulaire entraînant la mort cellulaire<sup> 1</sup>. La voie classique est activée par anticorps IgM et IgG et a d'abord été décrite comme un mécanisme pour tuer les bactéries. Avec la génération d'anticorps monoclonaux (mAb), la cascade du complément peut être utilisé pour lyser toute population de cellules d'une manière spécifique de l'antigène. L'épuisement des cellules par la cascade du complément est réalisé par l'ajout du complément spécifique de l'antigène de fixation des anticorps et de complément de lapin à la population de cellules de départ. Les cellules sont incubées pendant une heure à 37 ° C et les cellules lysées sont ensuite éliminés par deux tours de lavage. MAB avec une grande efficacité pour la fixation du complément normalement épuiser les 95-100% de la population cellulaire ciblée. Selon la stratégie de purification pour la population de cellules cibles, l'épuisement du complément peut être utilisé pour la purification de cellules ou pour l'enrichissement des populations de cellules qui peuvent ensuite être purifié par une méthode ultérieures.
Protocol
Discussion
La purification des populations de cellules est une procédure commune nécessaires à l'étude de leurs fonctions. Nous décrivons ici une méthode rapide et efficace de l'épuisement des populations de cellules en utilisant un antigène-anticorps spécifiques et de l'appauvrissement de complément. L'épuisement de toute la population de cellules peut être réalisé si un anticorps activant le complément est disponible à un marqueur de la lignée spécifique. Ici, nous avons démontré l'épuisement des cellules T en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques pour les Thy1, une protéine exprimée par la quasi-totalité des populations de cellules T. Nous appauvri plus de 95% des cellules T αβ et les splénocytes restants ont été augmenté de 68% à 98%. Ce niveau de pureté des cellules est similaire à d'autres stratégies de purification dont FACS et séparation magnétique perle. L'épuisement du complément est une technique rapide qui peut être effectué en 1,5 heures une fois que la population de cellules de départ est obtenu. Un autre avantage de l'épuisement du complément est que tout laboratoire peut effectuer la technique car elle ne nécessite pas de matériel coûteux et des réactifs. Les seuls éléments majeurs de l'équipement requis sont un bain d'eau et une centrifugeuse. Le complément de lapin peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs, à un coût raisonnable (voir le tableau des réactifs) et de nombreux anticorps monoclonaux peuvent être achetés auprès de CIFA et cultivé localement pour contrôler les coûts. En revanche, FACS nécessite un cytomètre en flux avec une capacité de tri de cellules, qui coûtera dans les six chiffres marqués par fluorescence et coûteux mAb. Séparation magnétique perle est à prix modéré, mais nécessite l'achat d'un aimant et les billes magnétiques, qui peut être coûteux. En outre, certaines stratégies de séparation magnétique perles exigent également l'achat de colonnes.
La principale pierre d'achoppement à l'utilisation du complément pour la déplétion des cellules est la disponibilité du complément activant mAb avec la spécificité d'antigène nécessaire. Bien que des anticorps humains, de souris et de rats ont tous la capacité à fixer le complément, certains isotypes sont mieux que d'autres. Bien que les IgM de ces trois espèces est très efficace pour la fixation de compléter les isotypes IgG varier. Ainsi, chaque mAb doit d'abord être testée dans une étude pilote pour déterminer son efficacité. Pour les anticorps qui ne sont pas très efficaces, deux tours de l'épuisement du complément peut être réalisée sans affecter la viabilité des populations de cellules restantes. Comme une des économies de coûts, les anticorps doivent être titrés pour une efficacité optimale. En outre, les anticorps utilisés n'ont pas besoin d'être purifié. Surnageants d'hybridome et travailler liquide d'ascite tout aussi efficacement, ce qui est particulièrement pratique pour les anticorps IgM, qui sont difficiles à purifier. Comme avec les anticorps, il est impératif que le complément sera titré en une étude pilote. Un haut trop de concentration va entraîner la perte de viabilité des populations de cellules non ciblées. Il est également important que le temps d'incubation ne dépasse pas 60 minutes.
Dans notre protocole, nous avons co-incubation de l'anticorps et le complément ensemble. Cependant, les cellules peuvent être étiquetés avec l'anticorps pendant 15-30 minutes et lavés avant l'ajout du complément. Lorsque vous utilisez cette stratégie, assurez-vous d'effectuer les incubations d'anticorps sur la glace pour empêcher la perte de l'antigène des cellules à la surface cellulaire, comme c'est le cas avec certaines protéines en patchant et le plafonnement ou l'internalisation du récepteur. Bien que très efficace, le principal inconvénient pour compléter l'épuisement par rapport à d'autres méthodes, c'est qu'il ne peut pas être utilisé pour la sélection positive. Ainsi, il est difficile d'obtenir des sous-populations de cellules. Par exemple, il serait difficile de purifier les cellules B de la zone marginale des cellules B folliculaire, qui serait mieux fait par FACS. Dans cette situation, l'activation du complément peut être utilisé pour épuiser les cellules T afin de réduire le nombre de cellules à trier. Cette stratégie permettrait de réduire le temps de trier, ce qui permettrait d'économiser de l'argent et serait moins sévère sur les cellules.
Depuis la purification des populations spécifiques de cellules est une exigence commune d'un certain nombre de stratégies ont été développées. Les principaux avantages de la stratégie de l'épuisement du complément sont son prix abordable, simplicité technique et des économies de temps.
Acknowledgements
Je tiens à remercier Sreemanti Basu pour fournir les données de la figure 1. Ce travail a été soutenu en partie par NIH AI069358 et la Fondation de recherche BloodCenter.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
Riferimenti
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
