Uitputting van specifieke celpopulaties door Complement Uitputting
Summary
Om effectief onderzoek naar de werking van het immuunsysteem celpopulaties hun zuivering vaak vereist is. Complement uitputting is een snelle en goedkope techniek voor de isolatie van het immuunsysteem van celpopulaties met hoge zuiverheid.
Abstract
De zuivering van het immuunsysteem celpopulaties is vaak nodig om hun unieke functies te bestuderen. In het bijzonder de moleculaire benaderingen, zoals real-time PCR en microarray analyse vereisen de isolatie van celpopulaties met hoge zuiverheid. Veelgebruikte zuivering strategieën omvatten fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), magnetische bead scheiding en een aanvulling uitputting. Van de drie strategieën, een aanvulling op uitputting biedt de voordelen van snel, goedkoop, zacht voor de cellen en een hoge cel opbrengst. Het complement systeem is samengesteld uit een groot aantal plasma-eiwitten die indien geactiveerd het initiëren een proteolytische cascade culminerend in de vorming van een membraan-attack complex dat een porie op een celoppervlak resulteert in celdood vormen<sup> 1</sup>. De klassieke route wordt geactiveerd door IgM-en IgG-antistoffen en werd voor het eerst beschreven als een mechanisme voor het doden van bacteriën. Met de generatie van monoklonale antilichamen (mAb), kan het complement cascade worden gebruikt om een celpopulatie lyseren in een antigeen-specifieke manier. Uitputting van de cellen door de complement cascade wordt bereikt door de toevoeging van complement de vaststelling antigeen-specifieke antilichamen en konijn aanvulling op de start celpopulatie. De cellen worden geïncubeerd gedurende een uur bij 37 ° C en de gelyseerde cellen worden vervolgens verwijderd door twee rondes van wassen. MAb met een hoog rendement voor het complement fixatie meestal afbrekende 95-100% van de beoogde celpopulatie. Afhankelijk van de zuivering strategie voor de beoogde celpopulatie, kan aanvullen uitputting worden gebruikt voor mobiele zuivering of voor de verrijking van celpopulaties die vervolgens verder kan worden gezuiverd door een latere methode.
Protocol
Discussion
De zuivering van celpopulaties is een gemeenschappelijke procedure vereist is voor de studie van hun functies. Hier beschrijven we een snelle en effectieve methode van uitputting van celpopulaties met behulp van antigeen-specifieke antilichamen en complement uitputting. De uitputting van een cel bevolking kan worden bereikt als een complement-activerende antilichaam beschikbaar is voor een lineage specifieke marker. Hier hebben we de uitputting van de T-cellen met behulp van een mAb specifiek voor Thy1 aangetoond, een eiwit uitgedrukt in wezen alle T-cel populaties. We uitgeput dan 95% van αβ T-cellen en de resterende splenocyten werden verhoogd van 68% tot 98%. Dit niveau van cel zuiverheid is vergelijkbaar met andere strategieën, inclusief de zuivering FACS en magnetische kraal scheiding. Complement uitputting is een snelle techniek die kan worden uitgevoerd in 1,5 uur na de start celpopulatie wordt verkregen. Een ander voordeel van complement uitputting is dat elk laboratorium kan de techniek uit te voeren, omdat het niet nodig dure apparatuur en reagentia. De enige belangrijke onderdelen van de apparatuur die nodig is zijn een waterbad en een centrifuge. Konijnencomplement kunnen worden gekocht bij verschillende leveranciers tegen een redelijke kostprijs (zie de tabel van de reagentia) en vele mAb kunnen worden gekocht bij ATTC en lokaal geteeld om de kosten te beheersen. In tegenstelling, FACS is een flowcytometer met mobiele sorteercapaciteit dat kost in de zes cijfers en dure fluorescent gelabelde mAb. Magnetische kraal scheiding is redelijk geprijsd, maar vereist de aanschaf van een magneet en magnetische kralen, die kan kostbaar zijn. Bovendien hebben sommige magnetische kraal scheiding strategieën vereisen ook de aankoop van kolommen.
Het voornaamste struikelblok voor het gebruik van de aanvulling voor celdepletie is de beschikbaarheid van complement activeren mAb met de nodige antigen specificiteit. Hoewel de mens, muis en rat-antilichamen hebben allemaal de capaciteit om complement te repareren, sommige isotypen zijn beter dan anderen. Hoewel IgM van alle drie de soorten is zeer effectief bij de vaststelling een aanvulling op de IgG-isotypes variëren. Dus elke mAb moet eerst worden getest in een pilot-studie om de doeltreffendheid ervan bepalen. Voor antilichamen die niet zeer efficiënt, kunnen twee rondes van complement uitputting worden uitgevoerd zonder dat de levensvatbaarheid van de resterende celpopulaties. Als een kostenbesparing, moet de antilichamen worden getitreerd voor een optimale effectiviteit. Daarnaast, doe de gebruikte antilichamen niet te worden gezuiverd. Hybridoma supernatants en ascites vloeistof werken net zo effectief, wat vooral handig is voor IgM-antilichamen, die moeilijk te zuiveren. Net als bij de antilichamen, is het noodzakelijk dat het complement worden getitreerd in een pilot-studie. Een te hoge concentratie zal resulteren in verlies van de levensvatbaarheid van niet-gerichte celpopulaties. Ook belangrijk is dat de incubatie tijd niet meer dan 60 minuten.
In ons protocol, we samen co-incubeer het antilichaam en het complement. Echter, kunnen de cellen gelabeld worden met antilichamen voor 15-30 minuten en gewassen voorafgaand aan de toevoeging van complement. Bij het gebruik van deze strategie, zorg ervoor dat het antilichaam incubaties uit te voeren op het ijs om het verlies van de cel-antigeen op het celoppervlak te voorkomen, zoals gebeurt met sommige eiwitten met een patch en de aftopping of receptor internalisatie. Hoewel zeer efficiënt, het belangrijkste nadeel van uitputting te vullen ten opzichte van andere methoden is dat het niet kan worden gebruikt voor positieve selectie. Zo is het moeilijk te verkrijgen subpopulaties van cellen. Bijvoorbeeld, zou het moeilijk zijn om marginale zone B cellen van folliculair B-cellen, die het best zou worden gedaan door FACS te zuiveren. In deze situatie kan complement activatie worden gebruikt om de T-cellen te verminderen tot het aantal cellen worden gesorteerd te verminderen. Deze strategie zou de soort tijd, dat zou geld te besparen en zou minder hard op de cellen.
Omdat de zuivering van specifieke celpopulaties is een veel voorkomende eis van een aantal strategieën ontwikkeld. De belangrijkste voordelen van het complement uitputting strategie zijn de betaalbaarheid, technische eenvoud en tijdsbesparing.
Acknowledgements
Ik wil Sreemanti Basu bedanken voor het verstrekken van de gegevens voor Figuur 1. Dit werk werd mede ondersteund door de NIH subsidie AI069358 en de BloodCenter Research Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
Riferimenti
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
