조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

1 부 : 알렉사 594 라벨 태아 1.1 Microinjection 플레이트 및 니들 준비 microinjection 플레이트 만들기 웨스 터 2007 년 1 기술을 사용하여 아가로 오스의 금형 내에서 다섯 1 mm 골짜기 세 가지로 구성된 사출 접시를 준비합니다. 이 골짜기는 효율적이고 체계적인 snuggly microinjections을위한 라인에 배아를 개최합니다. 전에 접시를 만들기 위해, 세 1 mm을 4 인치 길이 아닌 필라멘트 모세관 조심스럽게 반으로 그들을 깰. 이 2 인치 긴 모세관의 superglue, 접착제 두 사용되는 side – by – side는 평평한 표면에. 접착제는 세 번째는 세 개의 모세 혈관과 피라미드 모양을 만들고, 더 그로브에 자리잡고 있으며이 두 상단에 모세. 건조하고 충분한 "트러프 금​​형"이 건설되기 전까지는 반복 수 있습니다. 배아 매체에서 용융 1.5 % 아가로 오스의 (5mm 깊이) 20 – 25mL를 붓고 (EM) [5mM NaCl, KCl 0.17mM, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4 0.00003 %의 메틸렌 블루] 100mm 페트리 접시에. 바로 곰팡이는 배양 접시의 바닥에 닿으의 평면 측면을 보장 접시의 바닥에 이전 만든 피라미드 모양의 트러프 금​​형의 3-5를 놓고 완전히 아가로 오스가 있었다. 아가로 오스가 확정되면, 유리 모세관 금형는 제거되어야합니다. 제거하려면 세 모세관 금형을 포함하는 대형 아가로 오스 광장을 잘라 버릴거야. 부드럽게 컷 광장과 폐기의 주변에있는 한천을 이동시키다. 좋은 집게를 사용하여 사각형 한천을 통해 조각과를 플립, 완전히 트러프 금​​형을 제거합니다. 장소에 새로 성형 우물을 보유하기 위해 광장 주변의 페트리 접시에 녹은 아가로 오스 하거라. 책정할 수 있습니다. 번호판이 4 주 동안 봉인 및 저장 parafilm ° C. 수 있습니다 한천에 성장의 흔적에 폐기하십시오. microinjections위한 바늘. Micropipet 모세관 풀러 내부 필라멘트와 1 mm, 4 인치 유리 모세 혈관의 필요한 주입 바늘을 사용한다. 바늘이 550 열과 함께 Flamming / 브라운 Micropipet의 풀러를 사용하여 뽑아했고 120 힘 200의 속도 및 시간 / 200 지연을 가져옵니다. 1.2 엠브료 수집 및 Microinjection 장치 설치 그들이 EM 가득 배양 접시에 누워 유지 후 수정된 난자는 즉시 수집하고 있습니다. 형광 dextrans의 주입은 한 세포 단계 이상이고 16 세포 단계 2 완료해야합니다. 다양한 팁 유리 피펫을 사용하여 EM 가득한 실내 온도 분사 판의 우물에 배아를 추방. 부드럽게 푹 무딘 포셉과 골짜기의 바닥에 배아를 쐐기. 그의 chorion 또는 노른자 손상되었습니다 배아는 폐기해야합니다. 희석 형광 알렉사 594 솔루션 1 2μl (0.2 M KCl의 무게로 5 %)으로 주입 바늘을로드합니다. dextran이 주사 바늘의 길이를 실행하는 임베디드 필라멘트에 의한 모세관 작용에 의해 주입 바늘의 팁 여행 수 있습니다. stereotactic의 micromanipulator의 모세관 홀더에 주입 바늘을 연결합니다. 40-50 Psi를하고 500msec의 펄스 지속 시간으로 시작하는 microinjector 장치에 압력을 조정합니다. 부드럽게 포셉 (이상 직경은 0.05 – 0.15mm입니다)와 인감을 깰 수있는 주입 바늘의 팁을 방목. steromicroscope 사용하여 바늘을 교정하기 위해 그것을 위에 광유와 마이크로 미터에 dextran을 추방. 펄스의 공기 압력, 기간 및 바늘 끝의 크기를 조정하여 볼러스 크기를 수정합니다. 0.8 – 1nl의 볼륨에 해당 볼러스 크기는 주사 3에 걸쳐 유지되어야합니다. 종종 조언은 노른자 입자들로 가득 찼어 될 것입니다, 압력을 조정하거나 바늘 끝을 위반하면 문제를 완화 수도, 그렇지 않으면 새 주사 바늘을로드해야합니다. 형광등 알렉사 594 1.3 Microinjections 높은 배율에서 여물의 한쪽에서 시작, 자연스럽게 피어스 chorion 및 배아의 세포막은 노른자에 입력합니다. 막 세포에서 dextran 솔루션을 주사. 배아를 입력하는 데 사용되는 같은 부드러운 움직임과 주사 바늘을 제거했는지 확인하십시오. 다음 배아 인라인 위치와 여물의 길이를 주입 계속 배양 접시를 이동합니다. 주기적으로 압력 및 볼러스 크기를 확인합니다. 이것은 심각하게 배아 및 / 손상 또는 사출 바늘을 깰 가능성이로이 배아에서 때 주사 바늘을 이동하거나 구부하지 않도록주의하십시오. 부드럽게 포셉과 골짜기의 배아를 밀어. 항생제 펜 가득한 페트리 접시로 전송 / EM과 같이 Nusslein – Volhard 및 Dahm (2002) (1ml 6.5M CaCl 2, 1ml 3.5M NaHCO 3, 60mg/ml 페니실린, 100mg / 25ml 20x의 EM과 10ml에 설명된 단계 ML 스트렙토 마이신의 일나중에 transplantations 준비 ock). 28.5 unfertilized 계란이나 배아의 죽음에 대한 ° C와 모니터에서 배아를 품어. 2 부 : Gastrula 스테이지 Transplantations 2.1 Dechorionating 및 이식 플레이트 준비 접시를 Dechorionating. epiboly 부드러운 바닥 플레이트가있는만큼 이전에 설명한 1.5 % 아가로 오스 솔루션을 사용하여 자신의 노른자가 준수 사전 이식에 plastic.The 하루에 눈물이되지 요구를 완료하지 않았습니다 Dechorionated 배아가 5 쏟아져하여 dechorionating 접시를 100mm 페트리 접시에 용융 아가로 오스의 -10 ML. 아가로 오스 단 얇은 층 (2~3밀리미터)이 dechorination 동안 배아를 쿠션으로 필요합니다. 식지. 이식 번호판입니다. 전문 접시가 분리 우물과 4에서 설명한대로 만들었해야합니다. 100mm 페트리 접시에 1.5 % 아가로 오스 솔루션 30ml 붓고 잘 금형 이식을 삽입합니다. 곰팡이 104 삼각 divots 세 90도 측면으로 구성되어 각각 한 45도 직각 측면을 포함해야합니다. 웰스는 두 배아되는 side – by – side (그림 1A, 보라색 상자)를 개최하도록 설계되었습니다. 금형 아래에서 기포를 잡는 안됩니다. 아가로 오스 강화하자. 곰팡이를 제거하면 sloped 가장자리로 사각형 우물을 포함 침몰한 지역을 보여준다. 2.2 엠브료 및 이식 장치 설치 기증자와 호스트 태아의 위치 호스트와 기증자의 개발은 나이와 일치하는 pairings 가까이 유지하기 위해 모니터링해야합니다. 이렇게하려면 배아는 느려지거나 각각 개발 속도를 다양한 온도 (25-31 ° C)에서 제기하실 수 있습니다. 두 호스트 및 기증자의 배아는 사전이 5hpf에 의해 완료해야합니다 것입니다 gastrula 단계 이식의 경우에는 원하는 시대에 한천 – 코팅 dechorionating 플레이트 1시간에 dechorionated 손으로해야합니다. 5.5hpf 호스트 및 기증 배아에서 무대를 보호하기 전에는 항생 EM 가득한 이식 판으로로드됩니다. 배아는 유리 피펫을 사용하여 각 1 mm의 우물에로드됩니다. 다음과 같은 예제입니다 (한 배아 잘마다 한 줄에 아홉 배아)의 첫 번째 행에는 기증자의 배아으로 가득합니다 (18 총 잘마다 두 태아)와 다음 두 행이 호스트 배아로 가득합니다. 이식 장치 설정 이식은 완전 자동으로, 조이스틱 제어 줌 및 초점 조작을 자이스 혈구 Lumar 형광 입체 현미경을 실시하고 있습니다. 이식은 현미경의 자동화없이 할 수 있지만 그것은 획기적으로 간편하고 이식 높은 번호가 원하는 특히 효율성을 향상 않습니다. 그 규모의 중앙 위치로 Eppendorf AirTram를 설정합니다. 모세관 홀더에 AirTram (그림 1A, 빨간색 상자) 튜브를 연결하고 Eppendorf 자동의 micromanipulator (그림 1A)로 보유자를 확보. 이 micromanipulator 완전히 자동화하고 조이스틱이 제어. 다시,이 자동화 완전히 필요하지 않지만 상당히 주위와 배아에 바늘을 탐색하는 사람의 능력을 향상시킵니다. 그러나, 우리는 AirTram와 아무런 어려움이 없었도, 또는, 많은 연구자들은 세포 컬렉션의 부드러운 제어를 제공하는라고 OilTram을 선호합니다. 모세 혈관 사용은 15m의 팁 (그림 1A 녹색 상자)에서 팁 및 20도 각도로 구부러진 1mm에서 개막 beveled가 무균 Eppendorf TransferTips (ES)되었습니다. 2.3 Gastrula 스테이지 셀 이식 6hpf에서 micromanipulator를 사용하면 부드럽게의 정중선과 방패를 표시하고 모세관의 끝부분에 반대하는 등 휴대 extractions에 대한 위치에 배아를 회전하는 모세관의 끝에있는 배아를 방목. 세포를 손상시킬 공기 물 인터페이스를, 연락 세포의 기회를 방지하기 위해 모세관으로 EM의 작은 금액을 대기음. zebrafish 운명지도에 따라 forebrain에 세포를 타겟팅 정확히 동물 극과 방패 5 사이의 정중선에서 세포의 이식이 필요합니다. 부드럽게 피어스이 위치에 기증 배아의 ectoderm (Rhodamine의 주입 또는 GFP 형질 전환 배아). gastrula에 ectoderm과 기본 노른자 사이 세포의 두께는 얇은되며 이것은 종종 시간 이내에 죽음에 이르게하므로 따라서, 노른자를 찌르려고하지주의를 사용합니다. 모세관에 서서히 AirTram의 대기음 전지를 사용합니다. 항상 물 라인의 가시성을 유지합니다. 기증자 동안 끝에 약간의 동요는 세포 – 세포 연락처를 풀어하는 데 도움이 될 것입니다. 그것은 배아에서 제거되기 전에 기증자의 배아에서 약 10-50 세포가 추출해야합니다. 기증자, 마찬가지로 동양 호스트와 피어스의 모세관을 제거하고 정확한 SA에 세포를 추방동물 극과 호스트 배아의 방패 사이에 나를 위치. 이식 후, 기증자 및 호스트 배아는 우물에서 제거 분리 부드럽게 항생 EM 가득 한천 코팅된 배양 접시에 게재됩니다. 이식 우물에서 배아를 떠나는 것은 사망률을 증가시킵니다. 28.5에서 품어 배아는 ° C. 2.4 떠올리 및 이미징 태아 고정 및 라이브 배아를 장착. 형질 GFP 또는 Rhodamine 주입 배아에서 파생된 호스트 배아 살아있는 또는 고정 배아 시각과 몇 군데 있습니다. 우리는 여기서 모두 고정 및 라이브 영상 옵션의 예제를 제시한다. 수정의 배아는 C 1 4 박 0.1M 인산 버퍼 (PB)의 4 % paraformadehyde를 사용하여 30hpf에 희생되었다. 0.1M PB 3 X 5 분 후 씻어 배아는 2X 헹구세요. 우리가 제공하는 예제에서는 고정 호스트는 Acetylated Tubulin (α – AT)로 이전 6 설명한 향한 항체 모든 axons에 대한 immunolabeled되었습니다. 75 % 글리세롤의 장소 배아는 4 저장 후 상온에서 싱크와 ° C. 이 배아를 탑재 슬라이드를 준비합니다. 생성이 석유 젤리 스퀘어 광장 coverslip의 내부 모양과 직경과 일치하는 슬라이드에 설명합니다. 배아를 Deyolk와 forebrain의 정면 보려면, midbrain에 걸쳐 수직으로 절단하여 forebrain을 해부하다. 잘 석유 이내 글리세롤의 최소 금액이 조직을 놓으십시오. 동양의 적절한 위치에 조직 및 표본을 통해 coverslip을 넣으십시오. 라이브 표본은 유리 바닥 문화 요리에 Tricaine의 4 % 용액 (EM)에 만든 0.75 % 아가로 오스 솔루션에 탑재되었습니다. 전에 아가로 오스의 응고로, 배아는 이미지에 맞게 동양의 그것에 텅스텐 바늘로 조작할 수 있습니다. coverslip에 대한 직접적인 분석을 위해 우리가 지향 forebrain. 이미징 모두 고정 라이브 호스트는 Leica SP5 레이저 스캐닝 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. Z – 스택은 인수 3 있었다 – 또는 4 차원 이미지 프로세싱은 Volocity 소프트웨어를 사용하여 완성되었다. 결과 : forebrain에서 astroglial 세포의 역할을 주소로 노력에 모두 diencephalic 및 telencephalic 세포의 작은 클러스터 이러한 세포 및 대상 다양한 유전자 조작을 시각화하기 위해 필요합니다. 키메라 배아 이러한 유형의 생성하려면있는 배아 내의 astroglial 인구의 몇 가지 부분은 유전자형이나 표현형의 여부를 우리가 gastrula의 사용과, astroglia을 레이블 GFP 형질 전환 배아의 사용을 결합 다각적인 접근 방법을 사용하는 다른 세포 이식을 개최. 특히 diencephalon 우리의 클론을 타겟팅하려면, 우리는 선택적으로 동물 극과 방패 5 (그림의 1B)에서 등거리 중간선에서 세포를 추출하기 위해 zebrafish gastrula 운명의지도를 활용. 이러한 추출 TG [gfap : GFP] 세포 다음 다음 30hpf을 제기하고, forebrain의 해부학에 대한 참조 랜드마크로서 모든 axons (α – Tubulin Acetylated)에 대한 immunolabeled되었습니다 야생 유형 호스트 gastrula에서 동일한 위치에 이식했다. 하나의 호스트 배아의 예를 여기에 같이, 공촛점 영상은 telencephalon 및 diencephalon (그림 2A)에 걸쳐 고립 GFP + 세포를 보여줍니다. 이 GFP + 세포의 전체 형태는 이러한 세포의 대부분은 소마이 심실 영역에 인접해 있으며, 대규모 최종 발이에서 요골 프로세스를 종료하는 특성 요골 glial 형태에 걸릴 것을 드러내는이 clonal 분석에서 관찰할 수 pial 표면 (그림 2A, 삽입된 페이지). 이러한 수집 광학 조각의 Z – 스택의 세 가지 차원 렌더링 명확하게 표시된 axons (영화 1)에 대하여이 세포의 위치를​​ 보여주었다. 일반적으로 이식 세포를 시각화에 사용되는 또 다른 접근 방식이 처음 한 세포의 노른자에 같은 알렉사 594과 같은 형광 세포 혈통을 염색, microinject하는 것은 야생 입력하거나 GFP 형질 전환 배아를 개최. 예를 들면 우리는 한 세포 단계에서 야생 타입 배아로 알렉사 594을 주입. 우리는 그들이 방패 단계 gastrula로 개발을 허용하고 상기와 같은 forebrain 대상으로 이식을 실시하지만, 대신에 우리는 TG [gfap : nuc – GFP]로 이식 유전자 변형 호스트 gastrula. 레이저 스캐닝 공촛점 현미경으로 지느러미 telencephalon의 영상은 GFP 사이 기증자 세포의 형광 레드 클러스터 + forebrain (그림 2B) 내에 핵을 공개했다. 우리는 더욱 레이저 스캔 공촛점 두 시간의 과정을 통해 Z – 스택 매 3 분 수집하여이 호스트를 분석했다. Volocity 소프트웨어 (순발력)를 사용하여이 timelapse 4 차원 렌더링은 rhodamine 세포 점막 세포의 동적 움직임을 보여줍니다차 GFP + 핵 (영화 2). 그림 1의 더 큰 버전을보고 그녀를 클릭하십시오. 그림 1 : 실험 방법의 이식 장치 및 개략도. A) 기기 gastrula 단계 이식을 수행하는 데 사용됩니다. 자이스 혈구 Lumar 형광 입체 현미경은 이러한 이식을 수행하는 데 사용되었다. 그것은 조이스틱 제어 초점 확대 (적색 서클 왼쪽) 있습니다. Transferman 북한은 또한 조이스틱 제어 (오른쪽 붉은 동그라미)되는 모세관의 위치를​​ 조작하는 데 사용되었다. 설치하는 동안 60-80 배아는 이전에 다음 ID로 플라스틱 금형 (보라색 설명 상자)와 100mm는 배양 접시에 만들어진 각각의 한천 우물에 게재됩니다. eppendorf 제조 모세관 이식 (TransferTip)는 15μm 내경 열고 20도 직각 팁 (녹색 설명 상자)입니다. 세포의 열망은 Eppendorf의 AirTram (적색 설명 상자)로 제어됩니다. 호스트 배아에 기증자의 gastrula 단계 이식 절차 B) 그림. 배아 (여기 참조) 또는 알렉사 594 주입 (같은 프로토콜에 설명된) 기증 배아 : 세포 TG [GFP gfap]에서 추출됩니다. 세포는 중간 방패 동물 극 사이의 정중선에서 제거하고 호스트 태아의 동일한 지역으로 이식하고 있습니다. 호스트는 고정 및 공촛점 현미경 스캐닝 레이저를 사용하여 몇 군데 있습니다. 그림 2의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2. zebrafish의 forebrain 이내 gastrula 단계 이식의 예 이식 TG [gfap : GFP]와 함께 야생 타입 호스트 배아의) 정면 볼 수 있습니다. zebrafish의 forebrain의 diencephalons과 telencephalon에 세포. Axons은 빨간색으로 표시입니다 (α – Tubulin Acetylated 항체)와 이식 세포는 녹색 (내생 GFP 발현)에 표시됩니다. 배아는 30 HPF 있습니다. 삽입된 페이지 보여주는 GFP +는 세포의 요골 glial 형태. 이식 세포 (적색)을 fluorescing Rhodamine와 호스트 배아 : 라이브 TG [nuc – GFP gfap]의 telencephalon의 B) 도설 볼 수 있습니다. 호스트 배아의 핵은 녹색 (GFP)에 표시됩니다. 점선은 forebrain의 앞쪽에 표면을 설명합니다. 실선은 심실 영역을 나타냅니다. 스케일 바 10μm이다. 영화 1. . forebrain의 commissures 사이 ectopically 표시 방사형 glial 세포의 관계 gastrula의 세포가 개최 TG [gfap : GFP] 배아가 아닌 GFP 유전자 변형 야생 입력 라인에 이식했다. 공촛점 Z – 스택을 검사 레이저 Volocity 소프트웨어를 사용하여 3 – D 렌더링을 위해 수집하고 처리되었습니다. 처음에는 이미지가 30hpf에서 zebrafish forebrain의 정면 전망이며, 그것은 수평으로 2B 그림에 비해 이성을 상실했습니다. 앞쪽에 접합면 (AC, TOP) 후 광학 접합면 (POC, 하단) 내에서 Axons (A – Acetylated Tubulin, 빨강)을 볼 수 있습니다. 녹색 세포는 GFP + forebrain 및 생성된 명확한 레이디얼 glial 형태에 자리 잡았 이식 세포 수 있습니다. 영화가 진행되면 그것은 POC 연락을 최종 요금을 가진이 방사상 glial 세포에 초점을 맞추고 있습니다. 영화 1 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 영화 2. forebrain에서 이식 알렉사 594 라벨 세포의 Timelapse 이미징 이전 알렉사 594 주사 gastrula의 세포가 TG로 이식되었다. [gfap : nuc – GFP] 유전자 변형 배아. 이 영화는 Z – 스택이 5 분마다 찍은있는 2 시간의 timeseries의 3 차원 프로젝션을 나타냅니다. Z – 스택은 공촛점 현미경 스캐닝 레이저를 수집, 4 – D의 렌더링은 Volocity 소프트웨어를 사용하여 완료되었습니다. 이식 세포는 알렉사 594 (적색)으로 표시하고, GFP + 핵은 녹색입니다. 이 timelapse 실행으로서, 4D 이미지 30hpf에서 forebrain의 지느러미 볼 수있는 시작하고 명확 운동은 모든 이식 세포의 세포 점막과 GFP의 발견으로 X – 축에 대해 균등하게 돌아가며 게재됩니다 + 핵뿐만 아니라. 여기를 클릭하십시오 영화 2를 다운로드합니다.