Parte 1: Alexa 594 embrioni con etichetta 1,1 Piastra microiniezione e preparazione Needle Fare piastre microiniezione Preparare piatti iniezione comprende 3-5 di 1 mm depressioni all'interno di uno stampo di agarosio utilizzando una tecnica di Westerfield, 2007 1. Queste depressioni si snuggly tenere gli embrioni in una linea di microiniezioni efficiente e sistematico. Prima di effettuare i piatti, prendere tre 1-mm, 4-pollice di lunghezza non filamento capillari e cura le rompono a metà. Utilizzando colla, colla due di questi da 2 pollici capillari lungo fianco a fianco su una superficie piana. Incollare il terzo capillare su questi due, immerso nel bosco, creando una forma piramidale con i tre capillari. Lasciare asciugare e ripetere fino abbastanza "stampi attraverso" sono costruiti. Versare 20-25mL (profondità 5 mm) del fuso 1,5% di agarosio in media embrione (EM) [5mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mm di CaCl 2, 0,33 mm di MgSO 4 e blu di metilene 0,00003%] in un piatto da 100 millimetri di Petri. Immediatamente posto 04:57 del già fatto a forma di piramide stampi attraverso il fondo del piatto garantire la parte piatta dello stampo sta toccando il fondo della capsula di Petri e completamente ricoperto di agarosio. Quando l'agarosio si è solidificato, gli stampi capillare di vetro devono essere prese fuori. Per rimuovere, tagliare una grande piazza agarosio contenenti i tre stampi capillare. Delicatamente rimuovere l'agar alla periferia della piazza taglio e scarto. Capovolgere il pezzo quadrato agar oltre e, utilizzando una pinza sottile, rimuovere completamente gli stampi attraverso. Versare agarosio fuso nella capsula di Petri intorno alla piazza per tenere i pozzi di recente forgiati sul posto. Lasciate set. Piastre possono essere parafilm sigillato e conservato per settimane a 4 ° C. Eliminare i segni di una crescita in agar. Aghi per microiniezioni. Utilizzare un estrattore micropipetta capillare fare gli aghi di iniezione necessaria di 1 mm, da 4 pollici in vetro capillari con filamento interno. Gli aghi sono stati estratti utilizzando il Flamming / Estrattore micropipetta Brown con un calore di 550, trazione di 120, velocità di 200 e un tempo / ritardo di 200. 1,2 di raccolta degli embrioni e apparecchi installazione Microiniezione Uova fecondate sono immediatamente raccolti dopo che sono state stabilite e mantenute in una capsula di Petri riempite con EM. L'iniezione di fluorescenza destrani è ideale a una sola cellula palco e dovrebbe essere completato entro la 16-cellula fase 2. Con una pipetta di vetro larga punta, espellere gli embrioni nei pozzetti di una piastra di iniezione a temperatura ambiente pieno di EM. Delicatamente cuneo gli embrioni in fondo al avvallamenti con giunte pinze contundente. Gli embrioni cui corion o tuorlo sono stati compromessi devono essere eliminati. Caricare l'ago per l'iniezione con 1-2μl di diluito fluorescenti Alexa 594 soluzione (5% in peso per 0,2 M KCl). Lasciare che il destrano a viaggiare alla punta dell'ago da iniezione per azione capillare a causa del filamento incorporato che corre lungo l'ago per l'iniezione. Applicare l'ago di iniezione al titolare capillare di un micromanipolatore stereotassica. Regolare la pressione sull'apparato microinjector per iniziare con 40-50 Psi e la durata dell'impulso di 500msec. Sfiorare delicatamente la punta dell'ago da iniezione per rompere il sigillo con una pinza (diametro ideale è di 0.05-0,15 mm). Utilizzando un steromicroscope, espellere il destrano su un micrometro con olio minerale sopra di esso per calibrare l'ago. Modificare la dimensione del bolo regolando la pressione dell'aria, la durata dell'impulso e la dimensione della punta dell'ago. Una dimensione bolo equivalente ad un volume di 0,8 1nl dovrebbe essere mantenuta per tutta iniezioni 3. Spesso i suggerimenti saranno intasati dalle particelle di tuorlo; regolazione della pressione o la rottura della punta dell'ago può alleviare il problema, altrimenti un ago nuova iniezione deve essere caricato. 1,3 microiniezioni di fluorescente Alexa 594 In alto ingrandimento, partendo da un capo all'altro della vasca, facilmente forare il corion e membrana cellulare degli embrioni per entrare nel tuorlo. Iniettare la soluzione destrano appena sotto la cella. Assicurarsi di aver tolto l'ago di iniezione con lo stesso movimento morbido utilizzato per inserire l'embrione. Spostare la piastra di Petri per posizionare la linea successiva embrione e proseguire iniettando la lunghezza della vasca. Controllare la pressione e la dimensione del bolo periodicamente. Fare attenzione a non muovere o piegare l'ago di iniezione quando è in embrione come questo rischia di danneggiare fatalmente l'embrione e / o rompere l'ago per l'iniezione. Spingere delicatamente gli embrioni fuori dal depressioni con una pinza. Trasferirli su una piastra di Petri riempita con penna antibiotico / Passo EM, come descritto nella Nüsslein-Volhard e Dahm (2002) (1 ml 6.5M CaCl 2, 1ml 3.5M NaHCO 3, 25 ml 20x EM e 10 ml di 60mg/ml penicillina, 100 mg / ml di streptomicina °ock) in preparazione per i trapianti più tardi. Incubare gli embrioni a 28,5 ° C e monitor per le uova non fecondate o la morte dell'embrione. Parte 2: Trapianti stadio di gastrula 2,1 Dechorionating e piastra di preparazione dei trapianti Dechorionating piatti. Dechorionated embrioni che non hanno completato epiboly richiedono una piastra di fondo morbido in modo da non avere il loro tuorlo aderire e strappare il giorno plastic.The prima di trapianto, utilizzando la soluzione di agarosio 1,5% precedentemente descritto, fanno piatti dechorionating versando 5 -10 ml di agarosio fuso in un piatto 100 millimetri di Petri. Solo un sottile strato di agarosio (2-3mm) è necessario per ammortizzare gli embrioni durante dechorination. Lasciare raffreddare. Piastre di trapianto. Piatti specializzati con pozzetti separati devono essere fatte, come descritto in 4. Versare 30 ml della soluzione di agarosio 1,5% in un piatto 100 millimetri di Petri e inserire un trapianto ben stampo. Lo stampo dovrebbe contenere 104 divots triangolare ciascuna composta da tre lati 90 gradi e un lato inclinato di 45 gradi. I pozzi sono stati progettati per contenere due embrioni fianco a fianco (Fig. 1A, box viola). Fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto lo stampo. Lasciate che i indurire agarosio. Rimozione della muffa rivela una zona sommersa che contiene i pozzi piazza con un bordo inclinato. 2,2 embrioni e apparecchi installazione Trapianto Posizionamento dei donatori di embrioni e host Sviluppo degli eserciti e dei donatori devono essere monitorati per mantenere vicino di pari età abbinamenti. Per fare questo, gli embrioni possono essere sollevate a diverse temperature (25-31 ° C) per rallentare o accelerare lo sviluppo rispettivamente. Entrambe le serie e gli embrioni donatori dovrebbero essere dechorionated mano su una piastra di agar-rivestito dechorionating 1 ora prima l'età desiderata in caso di trapianto di stadio di gastrula questo dovrebbe essere completata entro 5hpf. Prima di scudo palco, a ospitare 5.5hpf ed embrioni donatori vengono caricati in un piatto pieno di trapianto EM antibiotico. Gli embrioni vengono caricati nel singolo 1-mm pozzi con una pipetta di vetro. Un esempio è la seguente: la prima fila è piena di embrioni di donatori (18 in totale, due embrioni per pozzetto) e le seguenti due file sono pieni di embrioni host (un embrione per pozzetto, 9 embrioni per riga). Configurare l'apparato di trapianto I trapianti vengono effettuate sulla Lumar stereo microscopio a fluorescenza Zeiss che è completamente automatizzato, zoom joystick controllato e la manipolazione messa a fuoco. Mentre i trapianti può essere fatto senza questa automazione del microscopio che fa aumentare notevolmente la facilità e l'efficienza specialmente quando un elevato numero di trapianti è voluta. Impostare il Airtram Eppendorf alla posizione centrale della sua scala. Collegare il (Fig. 1A, scatola rossa) Airtram tubi al titolare capillare, e fissare il supporto al micromanipolatore Eppendorf automatico (Fig. 1A). Questo micromanipolatore è completamente automatizzato e controllato joystick. Ancora una volta, questa automazione non è del tutto necessario, ma migliora notevolmente la capacità quelle di navigare l'ago intorno e dentro l'embrione. In alternativa, molti ricercatori preferiscono la OilTram che si dice di offrire più agevole il controllo della raccolta delle cellule, ma non abbiamo avuto difficoltà con la Airtram. I capillari sono stati utilizzati Eppendorf sterili TransferTips (ES) che hanno un 15 metri di apertura smussati in punta e un grado 20 piegata ad angolo 1 millimetro dalla punta (Fig. 1A scatola verde). 2,3 gastrula fase cella Trapianti A 6hpf, utilizzando il micromanipolatore dolcemente sfiorare l'embrione con la punta del capillare per ruotare l'embrione in posizione per l'estrazione delle cellule in modo tale che la sua linea mediana e scudo sono visibili e opporsi alla punta del capillare. Aspirare una piccola quantità di EM nel capillare per evitare qualsiasi possibilità di contatto con le cellule l'aria-acqua, che danneggerebbero le cellule. Sulla base della mappa destino zebrafish, il targeting di cellule del prosencefalo richiede il trapianto di cellule esattamente sulla linea mediana tra il polo animale e lo scudo 5. Delicatamente perforare l'ectoderma di embrioni donatore (iniettato rodamina o embrioni transgenici GFP) in questa posizione. Lo spessore delle celle tra l'ectoderma e il tuorlo alla base della gastrula è sottile, quindi, prestare attenzione a non impalare il tuorlo in quanto ciò spesso portare alla morte in poche ore. Utilizzando le cellule aspirato Airtram lentamente nel capillare. Mantenere sempre la visibilità della linea di galleggiamento. Lieve agitazione della punta, mentre nel donatore aiuterà a perdere cellula-cellula contatti. Circa 10-50 cellule l'embrione donatore deve essere estratto prima che venga rimosso dall'embrione. Rimuovere il capillare dal donatore, analogamente orientare l'ospite, e forare ed espellere le cellule nel esatta same posizione tra il polo animale e lo scudo degli embrioni ospitante. Dopo il trapianto, il donatore embrioni e l'host vengono rimossi dai pozzi, separati e gentilmente messo su un piatto rivestito di agar Petri riempite con EM antibiotico. Lasciando gli embrioni nei pozzetti trapianto aumenta la mortalità. Embrioni incubare a 28.5 ° C. 2,4 Visualizzare ed embrioni Imaging Montaggio embrioni fisso e vivere. Ospitare gli embrioni derivati da embrioni transgenici GFP o rodamina iniettato possono essere visualizzati e ripreso gli embrioni vivi o fissi. Presentiamo qui alcuni esempi di entrambe le opzioni con immagini fisse e in diretta. Fissare gli embrioni sono stati sacrificati a 30hpf utilizzando 4% paraformadehyde in 0.1M tampone fosfato (PB) durante la notte a 4 ° C 1. Sciacquare embrioni 2x e poi lavare 3 x 5 minuti in 0,1 M PB. Nell'esempio che forniamo, sono stati ospiti fissi immunolabeled per tutti gli assoni con anticorpi diretti contro Tubulin acetilato (α-AT), come descritto in precedenza 6. Embrioni posto nel 75% glicerolo, lavello a temperatura ambiente e poi conservare a 4 ° C. Preparare un vetrino per montare due embrioni. Creare due vaselina piazza delinea su una diapositiva che corrispondono alla forma e il diametro interno di un copri piazza. Deyolk un embrione e per una visione frontale del prosencefalo, sezionare fuori dal proencefalo tagliando perpendicolarmente attraverso il mesencefalo. Posto questo tessuto con una quantità minima di glicerolo all'interno del petrolio bene. Orientare il tessuto nella posizione appropriata e mettere un coprioggetto sopra il campione. Esemplare vivo sono stati montati in una soluzione allo 0,75% agarosio composto in una soluzione al 4% di Tricaine (in EM) su piatti fondo di vetro cultura. Prima della solidificazione agarosio, l'embrione viene manipolato con un ago di tungsteno per orientare correttamente per l'imaging. Per la nostra analisi abbiamo orientato il proencefalo direttamente contro il coprioggetto. Imaging Entrambi gli host fisso e vivi erano ripreso con la Leica SP5 microscopio confocale a scansione laser. Z-Stack sono stati acquisiti e 3 – o 4-dimensionale di elaborazione delle immagini è stato completato utilizzando il software Volocity. Risultati: Nel tentativo di affrontare il ruolo delle cellule astrogliali nel proencefalo è necessario per visualizzare sia le cellule bersaglio e manipolazioni genetiche per piccoli gruppi di cellule diencefalo e telencefaliche. Per generare questi tipi di embrioni chimerici, in cui una certa parte della popolazione astrogliali all'interno l'embrione è diverso sia dal genotipo o fenotipo, abbiamo utilizzato un approccio multiforme, che combina l'uso di embrioni transgenici GFP, che le etichette astroglia, con l'utilizzo di gastrula -messa in scena trapianto di cellule. Per i nostri cloni si rivolgono specificamente al diencefalo, abbiamo utilizzato il destino zebrafish gastrula mappa di estrarre selettivamente le cellule sulla linea mediana equidistante dal polo animale e lo scudo 5 (Fig. 1B). Questi estratti tg [GFAP: GFP] cellule sono poi state trapiantate nella stessa posizione in una serie gastrula tipo selvaggio, che è stata poi portata a 30hpf e immunolabeled per tutti gli assoni (α-tubulina acetilato) come punti di riferimento di riferimento per l'anatomia proencefalo. A titolo di esempio mostrato qui, l'imaging confocale di un embrione ospitare rivela isolato GFP + cellule in tutto il telencefalo e diencefalo (Fig. 2A). La morfologia pieno di queste + cellule GFP può essere osservato in questa analisi clonale, rivelando che la maggior parte di queste cellule assumono la caratteristica morfologia radiali gliali, dove si trova il soma adiacente alla zona ventricolare e un piede estremità grande termina un processo radiale al superficie piale (Fig. 2A, nel riquadro). Il rendering tridimensionale della Z-stack di queste fette raccolti ottico ha mostrato chiaramente la posizione di queste cellule rispetto alla assoni etichettati (Film 1). Un altro approccio comunemente utilizzato per la visualizzazione di cellule trapiantate è microinject inizialmente un colorante fluorescente linea cellulare, come Alexa 594, nel tuorlo d'una sola cellula scena wild-type o GFP embrione transgenico. Come esempio abbiamo iniettato Alexa 594 in embrioni wild-type in una cella di scena. Abbiamo consentito loro di sviluppare a scudo stadio di gastrula e poi effettuato il trapianto proencefalo mirati come detto sopra, ma invece abbiamo trapiantato in tg [GFAP: nuc-GFP] transgenici ospitare gastrula. Imaging del telencefalo dorsale al microscopio confocale laser a scansione ha rivelato rosso fluorescente cluster di cellule del donatore tra GFP + nuclei all'interno del prosencefalo (Fig. 2B). Abbiamo inoltre analizzato questo host attraverso la raccolta di Z-stack ogni tre minuti nel corso di due ore con la scansione laser confocale. 4-dimensionale rendering di questo Timelapse utilizzando il software Volocity (improvvisazione) mostra dinamica dei movimenti cellulari delle membrane cellulari rodamina uno° la GFP + nuclei (Movie 2). Clicca per vedere una sua versione più grande della figura 1. Figura 1: apparato trapianto e schematica di metodi sperimentali. A) Le apparecchiature utilizzate per condurre gastrula fase trapianti. Il microscopio a fluorescenza Zeiss Lumar stereo è stato utilizzato per condurre questi trapianti. Ha joystick fuoco controllato e lo zoom (a sinistra cerchio rosso). L'NK TransferMan è stato usato per manipolare la posizione del capillare che è anche joystick controllato (cerchio rosso a destra). Durante l'installazione 60-80 embrioni sono posti nei pozzetti agar individuali precedentemente fatte in una capsula di Petri 100 millimetri con uno stampo di plastica (viola casella delineato). Il trapianto capillare (TransferTip) prodotto da Eppendorf ha un'apertura 15μm diametro interno e una punta di 20 gradi angolo (scatola verde delineato). L'aspirazione delle cellule è controllata con Airtram Eppendorf (scatola rossa delineata). B) Illustrazione della procedura di trapianto da donatore stadio di gastrula in embrioni di accoglienza. Le cellule sono estratti da tg [GFAP: GFP] embrioni (qui) o Alexa 594 iniettato (come descritto nel protocollo) embrioni donatori. Le cellule vengono rimosse dalla linea mediana a metà strada tra lo scudo e polo animale, e trapiantati nella regione stessa di embrioni di accoglienza. Padroni di casa sono fissi e ripreso con scansione laser Microscopia confocale. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura 2. Figura 2. Esempio di trapianti stadio di gastrula all'interno del prosencefalo zebrafish A) Una vista frontale di embrioni di tipo selvaggio ospitare con trapiantato tg [GFAP: GFP]. Cellule del diencefalo e telencefalo del prosencefalo zebrafish. Assoni sono etichettati in rosso (α-tubulina acetilato anticorpi) e le cellule trapiantate sono etichettati in verde (GFP espressione endogena). Gli embrioni sono 30 HPF. Mostra inserto gliali radiali morfologia delle cellule GFP +. B) vista dorsale del telencefalo di un live tg [GFAP: nuc-GFP] embrione host con rodamina fluorescenti cellule trapiantate (rosso). Nuclei di embrioni host sono etichettati in verde (GFP). Linea tratteggiata delinea la superficie anteriore del proencefalo. Linea continua indica la zona ventricolare. Barra di scala è 10μm. Movie 1. . La relazione tra ectopica etichettati cellule gliali radiali tra commissure proencefalo cellule da una gastrula scena tg [GFAP: GFP] embrione sono stati trapiantati in un non-GFP line tipo transgenico selvatici. Una scansione laser confocale Z-Stack sono stati raccolti o successivamente trattati per 3-D di rendering con il software Volocity. Inizialmente, l'immagine è una vista frontale del prosencefalo pesce zebra a 30hpf, ed è stata capovolta orizzontalmente rispetto alla figura 2B. Assoni (a-acetilato tubulina, rosso) all'interno della commissura anteriore (AC, in alto) e post-ottica commessura (POC, in basso) si vedono. Le cellule verdi sono la GFP + cellule trapiantate che hanno messo radici nel proencefalo e ha generato chiara morfologia gliali radiali. Mentre il film procede si concentra su due in cellule gliali radiali tassa di possesso fine che contattare il POC. Clicca qui per scaricare film 1. Movie 2. L'imaging Timelapse di trapiantati Alexa 594 cellule marcate nel proencefalo cellule da una gastrula precedentemente iniettato con Alexa 594 sono stati trapiantati in tg. [GFAP: nuc-GFP] embrioni transgenici. Questo film rappresenta un 3-D la proiezione di una serie temporali 2h, in cui sono state Z-stack ogni 5 minuti. Z-Stack sono stati raccolti su un microscopio confocale a scansione laser, e 4-D rendering eseguiti con l'ausilio del software Volocity. Cellule trapiantate sono etichettati con Alexa 594 (rosso), e nuclei GFP + sono di colore verde. Poiché questo timelapse corre, l'immagine 4D inizia con una vista dorsale del prosencefalo a 30hpf e ruoterà circa l'asse X, come il movimento chiaro viene rilevato nelle membrane cellulari di tutte le cellule trapiantate e nella GFP + nuclei pure. Clicca qui per scaricare Movie 2.
