ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

חלק 1: Alexa 594 עוברים תווית 1.1 Microinjection פלייט הכנה מחט ביצוע צלחות microinjection הכינו צלחות הזרקת מורכבת 04:57 1 מ"מ שקתות בתוך עובש agarose בטכניקה ידי Westerfield, 2007 1. שקתות אלו מלבב להחזיק את העוברים בקו עבור microinjections יעיל ושיטתי. לפני ביצוע צלחות, לקחת שלושה 1 מ"מ, 4 אינץ' ארוך ללא נימה נימים בזהירות לשבור אותם במחצית. באמצעות דבק מגע, דבק שניים אלה 2 אינץ' נימים ארוך Side-by-בצד על משטח שטוח. דבק השלישי נימי על גבי שני אלה, השוכן בחורשת ויוצרים צורת פירמידה עם שלושת הנימים. ייבוש וחזור עד מספיק "תבניות שוקת" בנויים. יוצקים 20-25mL (עומק 5 מ"מ) של 1.5% agarose מותכת במדיום העובר (EM) [NaCl 5mm, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4 ו 0.00003% מתילן כחול] לתוך צלחת פטרי 100mm. מיד מקום 3-5 של תבניות בצורת פירמידה עשה בעבר שוקת לתחתית הצלחת להבטיח את הצד השטוח של עובש הוא נוגע בתחתית צלחת פטרי מכוסה לחלוטין על ידי agarose. כאשר agarose יש הקרושה, תבניות הזכוכית נימי חייב להילקח החוצה. כדי להסיר, לגזור ריבוע גדול agarose המכיל שלוש תבניות נימי. בעדינות לעקור את אגר בשולי הכיכר לחתוך וזורקים. תהפכו את פיסת אגר מרובע שוב, בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר לחלוטין את תבניות שוקת. יוצקים agarose מותכת לתוך צלחת פטרי סביב הכיכר כדי להחזיק את בארות יצוק החדש במקום. בואו נקבע. פלטות ניתן parafilm אטום מאוחסן במשך שבועות 4 ° C. מחק את סימני צמיחה בכל אגר. מחטים עבור microinjections. השתמש חולץ Micropipet נימי להפוך את מחטי הזרקה הכרחי מתוך 1 מ"מ, 4 אינץ' זכוכית נימים עם נימה פנימית. מחטים נשלפו באמצעות Flamming / פולר בראון Micropipet בחום של 550, למשוך כוח של 120, מהירות של 200, וזמן / עיכוב של 200. 1.2 העובר איסוף מנגנון ההתקנה Microinjection ביציות מופרות נאספים מיד לאחר שהם הניחו ומתוחזק בצלחת פטרי מלאות EM. הזרקת dextrans פלורסנט אידיאלי בשלב אחד התא אמור להסתיים שלב 16-התא 2. בעזרת פיפטה קצה רחב זכוכית, לגרש עוברים לתוך הבארות של צלחת טמפרטורה זריקה בחדר מלא EM. בעדינות טריז את העוברים לתוך החלק התחתון של שקתות עם מלקחיים בוטה שלובות. עוברים אשר סיסית או חלמון נפרץ אמור להיות מושלך. טען את מחט הזריקה עם 1-2μl של בדילול פתרון פלורסנט 594 אלקסה (5% לפי משקל של 0.2 M KCl). אפשר dextran לנסוע קצה המחט להזרקת ידי פעולה נימי בשל החוט מוטבע לאורכו של מחט הזריקה. צרף את מחט הזריקה לבעל נימי של micromanipulator stereotactic. התאם את הלחץ על המנגנון microinjector להתחיל עם 40-50 Psi משך הדופק של 500msec. לרעות בעדינות את קצה המחט להזרקת לשבור את חותם עם מלקחיים (קוטר האידיאלי הוא 0.05-0.15mm). שימוש steromicroscope, לגרש את dextran על מיקרומטר עם שמן מינרלי על גבי אותו כדי לכייל את המחט. שנה את גודל בולוס ידי התאמת לחץ האוויר, משך הדופק ואת גודל של קצה המחט. גודל בולוס שווה בהיקף של 0.8-1nl צריך להישמר לאורך 3 זריקות. לעתים קרובות טיפים יסתמו עם חלקיקים חלמון, התאמת לחץ או לשבור את חוד המחט עשוי להקל על הבעיה, אחרת מחט הזריקה החדש חייב להיות טעון. 1.3 Microinjections של פלורסנט אלכסה 594 תחת הגדלה גבוהה, החל מקצה אחד של השוקת, חלקה לנקב את סיסית ו קרום התא של העוברים להיכנס לתוך החלמון. להזריק את הפתרון dextran ממש מתחת לתא. הקפד להסיר את המזרק עם התנועה חלקה אותה משמש כדי להזין את העובר. הזז את צלחת פטרי לתפקיד מוטבעות העובר הבא ולהמשיך להזריק לאורך השוקת. בדוק את הלחץ ואת גודל בולוס מעת לעת. היזהר שלא להזיז או לכופף את מחט הזריקה כאשר הוא בעובר כמו זה עלול לפגוע אנושות העובר ו / או לשבור את מחט הזריקה. דחף בעדינות את העוברים מתוך שקתות עם מלקחיים. העברת אותם בצלחת פטרי מלאות פן אנטיביוטי / שלב EM כמתואר Nusslein-Volhard ו Dahm (2002) (1ml 6.5M CaCl 2, 1ml 3.5m NaHCO 3, 25ml 20x EM ו 10 מ"ל של 60mg/ml פניצילין, 100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין רחובock) לקראת השתלות מאוחר יותר. לדגור העוברים על 28.5 ° C ו לפקח על ביצים מופרית או מוות לעובר. חלק 2: השתלות Gastrula שלב 2.1 Dechorionating ו פלייט הכנה להשתלות Dechorionating צלחות. עוברי Dechorionated כי לא סיימו את epiboly דורשים צלחת תחתית רכה כדי לא להיות חלמון שלהם לדבוק מדמיע ביום plastic.The לפני השתלות, תוך שימוש בפתרון 1.5% agarose שתואר קודם לכן, לעשות צלחות dechorionating ידי שפיכת 5 -10 מ"ל של agarose מותכת לתוך צלחת פטרי 100mm. רק בשכבה דקה של agarose (2-3mm) נדרש כרית עוברים במהלך dechorination. בואו מגניב. צלחות להשתלות. Specialized צלחות עם בארות מופרדות צריך להתבצע כפי שמתואר 4. יוצקים 30 מ"ל של התמיסה agarose 1.5% לתוך צלחת פטרי 100mm והכנס השתלת גם עובש. עובש אמור להכיל 104 divots כל משולש מורכב משלושה צדדים 90 מעלות צד אחד בזווית 45 מעלות. בארות נועדו להחזיק שני עוברים Side-by-הצד (איור 1A, תיבת סגולים). הקפד לא מלכודת בועות אוויר תחת התבנית. תן להקשיח agarose. הסרת עובש מגלה אזור שקועות המכיל את בארות מרובע עם קצה משופע. 2.2 העובר מנגנון ההתקנה להשתלות המיקום של עוברים התורם מארח פיתוח של המארחים ותורמים צריכים להיות במעקב כדי לשמור קרוב לגיל מתאימים זיווגים. לשם כך, עוברים ניתן להעלות בטמפרטורות שונות (25-31 ° C) להאט או להאיץ את הפיתוח בהתאמה. שתי המארחות עוברים התורם צריך להיות על יד dechorionated שעה אגר מצופה צלחת 1 dechorionating לפני גיל הרצוי במקרה של השתלות gastrula בשלב זה היה צריך להסתיים עד 5hpf. לפני מגן הבמה, בבית המארח 5.5hpf ועוברים התורם נטענים לתוך הצלחת השתלת מלא EM אנטיביוטי. עוברים נטענים לתוך 1 מ"מ בארות הפרט באמצעות פיפטה מזכוכית. דוגמה לכך היא כדלקמן: השורה הראשונה מתמלא עוברים התורם (18 בסך הכל, שני עוברים בכל טוב) ואת שתי השורות הבאות מלאים עוברים מארח (אחד העובר בכל טוב, 9 העוברים בכל שורה). הגדרת מנגנון ההשתלה השתלות מתבצעות על המיקרוסקופ Zeiss סטריאו Lumar פלורסנט כי יש אוטומטי לחלוטין, מבוקר זום ג'ויסטיק ומניפולציה להתמקד. בעוד השתלות ניתן לעשות זאת ללא מיכון זה של המיקרוסקופ היא עושה להגדיל באופן משמעותי את נוחות ויעילות במיוחד כאשר מספר רב של השתלות הוא הרצוי. הגדר את AirTram Eppendorf למיקום האמצעי של קנה המידה שלו. חבר את צינורות (איור 1A, תיבה אדומה) AirTram לבעל נימי, ולאבטח את מחזיק עד micromanipulator Eppendorf אוטומטיות (איור 1A). Micromanipulator זה הוא אוטומטי לחלוטין ג'ויסטיק מבוקר. שוב, אוטומציה זה לא הכרחי לחלוטין אבל משפר משמעותית את אלה היכולת לנווט את המחט סביב אל העובר. לחלופין, חוקרים רבים מעדיפים את OilTram כי הוא אמר להציע שליטה חלקה של אוסף תאים, אולם לנו לא היו קשיים עם AirTram. השתמשו נימים היו עקרים Eppendorf TransferTips (ES) כי יש 15 מ 'משופעים פתיחת בקצה וכן כפופות 20 מעלות זווית 1mm מקצה (איור תיבת 1A ירוק). 2.3 תא Gastrula שלב השתלות בשלב 6hpf, באמצעות micromanipulator בעדינות לרעות את העובר עם קצה של נימי לסובב את העובר במצב של התא עקירות כאלה קו האמצע שלה מגן נראים מנוגדים קצה נימי. לשאוב כמות קטנה של EM לתוך נימי כדי למנוע כל סיכוי של התאים ליצור קשר עם ממשק אוויר ומים, אשר תפגום את התאים. בהתבסס על מפת גורל דג הזברה, מיקוד התאים forebrain מחייב השתלה של תאים על קו האמצע בדיוק בין הקוטב בעלי חיים מגן 5. בעדינות לנקב את האאקטודרם עוברים התורם (מוזרק Rhodamine או GFP עוברים מהונדס) במיקום זה. העובי של תאים בין האאקטודרם וחלמון הבסיסית gastrula הוא דק, ולכן השימוש זהירות שלא לדקור את החלמון כמו זה יהיה לעיתים קרובות לגרום למוות תוך שעות ספורות. שימוש בתאים לשאוב AirTram לאט לתוך נימי. תמיד לשמור על הנראות של קו המים. תסיסה קלה של קצה ואילו התורם יעזור רופף תאים תאים קשר. כ 10-50 תאים מעובר התורם צריך להיות חילוץ לפני שהוא הוסר העובר. הסר את נימי מתורם, בדומה לכוון את המארח, ובא בכפו ונקבה ולגרש את התאים לתוך sa המדויקלי מיקום בין הקוטב מגן החיות של עוברים המארח. לאחר ההשתלה, העוברים התורם מארח יוסרו מן הבארות, מופרדים והניח בעדינות על צלחת פטרי מצופה אגר מלא EM אנטיביוטי. השארת עוברים את הבארות השתלת מגביר תמותה. עוברים דגירה על 28.5 ° C. 2.4 הדמיה עוברים הדמיה הרכבה עוברים קבוע לחיות. עוברים מארח נגזר מהונדס GFP או עוברים Rhodamine מוזרק ניתן דמיינו הדמיה עוברים בחיים או קבועים. אנו מציגים כאן דוגמאות של שתי האפשרויות הדמיה קבוע לחיות. עוברים תיקון הוקרבו על 30hpf באמצעות paraformadehyde 4% ב 0.1M פוספט חיץ (PB) לילה ב 4 ג 1. שטפו עוברי 2x ולאחר מכן לשטוף 3 x 5 דקות 0.1M PB. בדוגמה אנו מספקים, המארחים היו immunolabeled קבוע עבור כל האקסונים עם נוגדנים המכוונים נגד Acetylated טובולין (α-AT) כפי שתואר לעיל 6. עוברים מקום גליצרול 75%, כיור בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C. הכן שקופית הר שני עוברים. צור שתי וזלין מרובע מתאר בשקופית התואמים את הצורה הקוטר הפנימי של coverslip ריבוע. Deyolk העובר ואת עבור תצוגה חזיתית של המוח הקדמי, לנתח את המוח הקדמי על ידי חיתוך בניצב ברחבי המוח התיכון. המקום הזה רקמה עם כמות מינימלית של גליצרול בתוך נפט היטב. המזרח רקמות למצב המתאים למקום coverslip על הדגימה. דוגמה חיה היו רכוב בפתרון agarose 0.75% מורכב בפתרון 4% Tricaine (ב EM) על תחתית צלחות זכוכית תרבות. לפני גיבוש agarose, העובר הוא מניפולציה בעזרת מחט טונגסטן כראוי לכוון אותה הדמיה. בניתוח שלנו אנו forebrain מכוונת ישירות נגד coverslip. הדמיה המארחים שני קבוע ולחיות היו הדמיה באמצעות לייזר Leica SP5 מיקרוסקופ סריקה Confocal. Z-ערימות נרכשו ו – 3 או 4 מימדי עיבוד התמונה הושלמה באמצעות תוכנת Volocity. תוצאות: בניסיון להתמודד עם תפקיד של תאים astroglial בקידמתו יש צורך הן לדמיין אלו תאים שונים היעד מניפולציות גנטיות אשכולות קטנים של תאים diencephalic ו telencephalic. כדי ליצור סוגים אלה של עוברי chimeric, שבו חלק מן האוכלוסייה astroglial בתוך העובר שונה בין אם על ידי גנוטיפ או פנוטיפ, השתמשנו בגישה רבת המשלבת את השימוש בעוברים GFP מהונדס, אשר תוויות astroglia, עם השימוש gastrula שלבי השתלת תאים. כדי שמתמקדים שיבוטים diencephalon שלנו, אנחנו ניצלו את המפה gastrula דג הזברה גורל באופן סלקטיבי תאים לחלץ את קו האמצע במרחק שווה מן הקוטב בעלי חיים מגן 5 (איור 1B). אלה חילוץ TG [GFAP: GFP] התאים הושתלו מכן לתוך באותו מיקום שורה פרוע סוג gastrula, אשר הועלתה לאחר מכן 30hpf ו immunolabeled לכל אקסונים (α-Acetylated טובולין) כציוני דרך התייחסות לאנטומיה forebrain. כדוגמה המוצגת כאן, הדמיה confocal של העובר מארח אחד מגלה מבודד GFP + תאים ברחבי telencephalon ו diencephalon (איור 2 א). מורפולוגיה המלאה של אלה + תאים GFP ניתן לצפות assay זה המשובטים, חושף כי רוב התאים האלה לקחת על המורפולוגיה האופיינית גליה רדיאלי, שם סומה ממוקם סמוך לאזור חדרי וכף רגל בסוף גדול מסתיים התהליך הרדיאלי בבית משטח pial (איור 2A, הבלעה). עיבוד תלת ממדי של מחסנית-Z של אלה פרוסות אופטי שנאספו הראו בבירור את המיקום של תאים אלה ביחס אקסונים שכותרתו (סרט 1). גישה נוספת הנפוצה המאפשר הדמיה התאים המושתלים היא בתחילה microinject תא פלורסנט השושלת צבע, כגון Alexa 594, בחלמון של תא אחד מבוימת סוג בר או העובר GFP מהונדס. כדוגמה אנו מזריקים אלקסה 594 לעוברי סוג בר בשלב אחד התא. הנחנו להם לפתח לגונן בשלב gastrula ואז ביצע השתלת forebrain ממוקד כאמור לעיל, אך במקום זאת אנו הושתלו TG [GFAP: nuc-GFP] מהונדס מארח gastrula. הדמיה של telencephalon הגבי על ידי מיקרוסקופ לייזר Confocal סריקה חשף אשכולות אדום ניאון של תאים התורם בין GFP + גרעינים בתוך forebrain (איור 2B). בנוסף, אנו ניתח מארח זה על ידי איסוף Z-ערימות כל שלוש דקות במשך שעה שתיים עם Confocal סריקת לייזר. 4 ממדי טיוח של timelapse זה באמצעות תוכנה Volocity (אימפרוביזציה) מראה תנועות הסלולר הדינמי של קרום התא rhodaminend-GFP + גרעינים (סרט 2). לחץ עליה כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. איור 1: מנגנון להשתלות ו סכימטי של שיטות ניסיוניות. Apparatus) המשמש לנהל gastrula בשלב השתלות. המיקרוסקופ Lumar Zeiss סטריאו פלורסנט שימש לנהל השתלות אלה. יש למקד את הזום נשלט ג'ויסטיק ו (משמאל עיגול אדום). NK Transferman שימש כדי לתפעל את המיקום של נימי שהוא גם ג'ויסטיק מבוקר (מימין עיגול אדום). במהלך ההתקנה 60-80 עוברים ממוקמות לתוך בארות אגר אדם עשה בעבר עם עובש פלסטיק (תיבת התווה סגול) בצלחת פטרי 100mm. השתלת נימי (TransferTip) שיוצרו על ידי Eppendorf יש פתיחת 15μm קוטר פנימי טיפ בזווית 20 מעלות (תיבת התווה ירוק). השאיפה של תאים נשלטת עם AirTram Eppendorf של (תיבת התווה אדום). ב) איור של ההליך בשלב gastrula השתלה מתורם לעוברי המארח. תאים המחולצים TG [GFAP: GFP] עוברי (ראה כאן) או אלקסה 594 מוזרק (כפי שמתואר בפרוטוקול) עוברים התורם. תאים יוסרו קו האמצע באמצע הדרך בין מגן לבין קוטב חיה, הושתלו באותו אזור של עוברים המארח. המארחים הם קבועים צילמו באמצעות סריקת לייזר מיקרוסקופיה confocal. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2. איור 2. דוגמה השתלות gastrula שלב בתוך forebrain דג הזברה) השקפה חזיתית של בר מארח עוברים סוג עם המושתלים TG [GFAP: GFP]. תאים diencephalons ו telencephalon forebrain של דג הזברה. האקסונים מסומנים באדום (α-Acetylated נוגדן טובולין) ואת התאים המושתלים מסומנים ב (ביטוי של GFP אנדוגני) ירוק. הם עוברים 30 hpf. הבלעה מראה מורפולוגיה גליה רדיאלי של התאים GFP +. ב) להציג הגבי של telencephalon של לחיות [GFAP: nuc-GFP] TG העובר לארח עם Rhodamine fluorescing התאים המושתלים (אדום). גרעינים של עוברים מארח מסומנים בצבע ירוק (GFP). קו מקווקו מתאר את פני השטח הקדמי של המוח הקדמי. קו מוצק מציין את אזור חדרית. סרגל קנה המידה 10μm. סרט 1. . יחסי שכותרתו ectopically ותאי גלייה רדיאלי בין commissures forebrain תאים gastrula מבוימת TG [GFAP: GFP] העובר הושתלו קו מהונדס הלא GFP סוג בר. סריקת לייזר Confocal Z-Stack נאסף ומעובד לאחר מכן טיוח 3-D באמצעות תוכנת Volocity. בתחילה, התמונה היא תצוגה חזיתית forebrain של דג הזברה ב 30hpf, וזה כבר הפך אופקית לעומת תרשים 2B. אקסונים (א-Acetylated טובולין, אדום) בתוך השליכה הקדמי (AC, למעלה) ופוסט אופטיים שליבה (POC, למטה) נראים. התאים הירוקים הם GFP + התאים המושתלים שהשתרשה forebrain ומורפולוגיה שנוצר ברור גליה רדיאלי. ככל שהסרט מתקדם הוא מתמקד בשני ותאי גלייה רדיאלי בעל אגרה לשם כך פנה POC. לחץ כאן כדי להוריד סרט 1. סרט 2. Timelapse הדמיה של המושתלים אלקסה 594 תאים תווית בקידמתו תאים gastrula מוזרק בעבר עם אלכסה 594 הושתלו TG. [GFAP: nuc-GFP] עוברים מהונדס. סרט זה מהווה השלכה 3-D של timeseries 2h, בה Z-ערימות נלקחו כל 5 דקות. Z-ערימות נאספו על לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal, ו 4-D renderings השלימה באמצעות תוכנת Volocity. התאים המושתלים מסומנים עם Alexa 594 (אדום), גרעינים GFP + ירוקים. כפי timelapse זה פועל, התמונה 4D מתחיל עם נוף הגבי של המוח הקדמי ב 30hpf ויהיה לסובב על ציר ה-X, כמו תנועת ברור הוא זוהה על קרום התא של כל התאים המושתלים וב-GFP + גרעינים גם. לחץ כאן כדי להוריד סרט 2.