In elettroporazione in vivo ed ex utero per l'espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

Parte 1: Impostazione per in utero ed ex electroporations vivo della retina 1. Per entrambi in utero ed ex electroporations vivo della retina Utilizzare un elettrodo estrattore per preparare punta fine micropipette e rompere la punta (o smussare la punta) per fare un punto angolo. Preparare le soluzioni di DNA a concentrazioni desiderato e aggiungere una piccola quantità di Fast Green Dye (0,05%) per visualizzare le iniezioni. Raccomando 5 ul di soluzione DNA per madre per electroporations in utero della retina e 1 soluzione di DNA microlitri pro capite embrionali per la ex electroporations vivo della retina. Includono un costrutto GFP (o altre proteine ​​fluorescenti) per visualizzare i neuroni transfettate. Sterilizzare gli strumenti chirurgici tramite autoclave. Preparare la ketamina, anestetico xylazina mix con il seguente rapporto (rendendo ~ 0,2 ml per ogni donna in gravidanza): un 1.0:0.2:4.6 rapporto volumetrico di 100 mg / ml di ketamina: 100 mg / ml xylazina: salina. Anestetici possono essere utilizzati altri. 2. Per electroporations in utero della retina solo Accendere il riscaldamento pad e coprire con un tampone pannolino. Preparare la soluzione di antibiotico-antimicotico (1:100) in soluzione salina tampone fosfato (PBS) e caldo su piastra elettrica. Preparare ~ 2 ml per ogni diga. Luogo sterile filtrata PBS in bagno d'acqua calda. 3. Per gli ex electroporations vivo della retina solo Preparare ossigenato media i livelli di free (SFM) per l'incubazione retina: Bubble 25 ml di DMEM/F12 con il 95% di ossigeno / anidride carbonica del 5% per ≥ 2 ore. Al supporto di 25 ml ossigenato, aggiungere 0,25 g di albumina sierica bovina (BSA), 250 microlitri suo supplemento e 50 microlitri penicillina-streptomicina soluzione. Miscelare la soluzione per sciogliere la BSA, quindi filtrare la soluzione sterile. Questa soluzione deve essere fresco per ogni esperimento elettroporazione. Preparare medio metilcellulosa SFM + 0,4% per l'incubazione della retina espianto: Autoclave 0,20 g di metilcellulosa in una bottiglia da 150 ml con un magnete mescolare. Preparare 50 ml di SFM (come sopra, senza bolle) e aggiungere alla bottiglia metilcellulosa sterilizzati in autoclave. Mescolare questa soluzione a 4 ° C durante la notte. Filtro sterile questa soluzione il giorno successivo e conservare a 4 ° C, questa soluzione può essere conservata per circa 1 mese. Il giorno della raccolta espianto della retina (parte 5), preparare piatti per la placcatura espianto della retina: Cappotto di vetro piatti cultura fondo con 250 microlitri di poli-L-ornitina per ≥ 2 ore a 37 ° C. (In alternativa, i piatti possono essere rivestiti con poli-L-ornitina il giorno precedente e incubate overnight a 4 ° C) Lavare i piatti più volte con PBS, poi piatti a mano con 200 ml di 10 mg / ml laminina in DMEM/F12 per ≥ 2 ore a 37 ° C. Lavare i piatti più volte con PBS a 37 ° C e lasciare in PBS fino espianti sono pronti per la placcatura. Per le analisi di frontiera, piatti cappotto con poli-ornitina come sopra, allora la metà del mantello il piatto con proteina di interesse con un marcatore fluorescente per visualizzare il bordo (come Alexa Fluor 555 coniugato con BSA, 1:800) per 2 ore a 37 ° C. Lavare con PBS, quindi aggiungere la laminina come descritto sopra. Parte 2A: In elettroporazione utero della retina iniezione e electroporating DNA in E14.5 retina murini in vivo Iniettare 0,15 ml del intraperitoneale mix di anestetico (ip) in una diga E13.5 E14.5-stadio. Si dovrebbero prendere 3-7 minuti fino a quando la madre ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia. Un mouse completamente anestetizzati non dovrebbe rispondere a pizzicare del hindpaw. Durante questo tempo, tagliare un piccolo pezzo di parafilm e pipetta ~ 5 ul di soluzione di DNA sul parafilm. Piegare un pistone (filo metallico) in un angolo di 90 ° gradi e inserirla in un micropippette tirato. Utilizzando lo stantuffo, aspirare la soluzione di DNA nel micropipetta (utilizzando un microscopio da dissezione può aiutare questo processo). Una volta che la madre ha raggiunto un aereo di anestesia chirurgica, uso un rasoio elettrico a radere un ~ 2 pollici regione del ventre della madre s, poi posto il suo lato dorsale giù sulla rampa di riscaldamento. Prep l'area rasata strofinando con un tampone di alcool seguita da un pad iodio un minimo di due volte. Mettere una goccia di pomata oftalmica Vet su ciascun occhio per evitare ulcerazioni della cornea degli occhi, mentre la madre è in anestesia generale. Con le pinze, afferrare la pelle e usare le forbici per fare un'incisione verticale lungo la linea mediana (~ 1 pollice di lunghezza) attraverso la pelle ei muscoli dell'addome, esponendo il peritoneo. Sollevare il peritoneo con le pinze e fare un'incisione simile verticale attraverso questa membrana per esporre la cavità addominale (Figura 1). Poi drappo il campo chirurgico con garze per evitare che il contenuto addominale da contattare ed essere contaminati per i capellidell'animale. Tirare indietro la pelle e peritoneo con le pinze e usare la spatola dissezione per estrarre un embrione attraverso l'incisione (scegliere l'embrione più accessibile). Posizionare la spatola tra 2 embrioni e tirare delicatamente la catena embrionale dalla cavità addominale. Si può tirare fuori la catena embrionale con le dita. * Da questo punto in avanti, tenere gli embrioni idratata con PBS sterile * Mantenere la madre sulla rampa di riscaldamento, il suo posto sotto il microscopio da dissezione e massaggiare un embrione in modo che la retina è rivolto verso l'alto. Mi consiglia di iniziare con l'embrione sia più mediale o laterale, rendendo più facile per tenere traccia dei quali sono stati elettroporate embrioni. Prendere la micropipetta in mano dominante e stabilizzare l'embrione con l'altra mano. Con la micropipetta, perforare la retina attraverso la parete uterina e sacco amniotico. A seconda della nitidezza della micropipetta, può richiedere una discreta quantità di pressione di penetrare la parete uterina, ma una volta attraverso la micropipetta entrerà idealmente l'embrione e la retina. Può essere difficile da controllare e misurare la profondità della micropipetta, che entra nella embrione. Minimizzare la quantità di movimento micropipetta una volta che ha trafitto la membrana per evitare che allargando il foro di entrata, con conseguente fuoriuscita di liquido amniotico e la morte dell'embrione. Evitare di vasi sanguigni penetrante nella parete uterina, come questo si tradurrà in emorragia e la morte dell'embrione. Una volta si è certi che la micropipetta è entrato nella retina, si è pronti a espellere la soluzione di DNA nella retina. Premere lentamente lo stantuffo e contemporaneamente ritirare la micropipetta, assicurando che il DNA è iniettato in tutto il percorso della micropipetta, come spesso micropipetta penetra in profondità per la retina. Se siete nella retina, espellere 0,5 microlitri (può essere misurata con il 1 tacche microlitri sulla micropipetta) nello spazio extraretinal tra lo strato esterno della retina e l'epitelio pigmentato retinico (RPE). Si dovrebbe osservare colorante verde riempire la retina e fuoriesce nel liquido amniotico (Figura 1). Le pale elettroporazione dovrebbe essere tenuto in un PBS pieno di Petri durante l'intervento. Posizionare con delicatezza le palette sui lati della testa dell'embrione con il polo positivo (+) pagaia dalla stessa parte dove l'occhio iniettato. Applicare una moderata quantità di pressione per stabilizzare la testa, ma non premere troppo forte, in quanto questo si aprirà il sacco amniotico e provocare la morte dell'embrione. Quando gli elettrodi sono in atto, fornire 5 40-V, 50 ms impulsi quadrati a una frequenza di 60 Hz. Non è insolito per la madre di contrazione dovute a fughe di corrente per la pelle e muscoli. Ripetere i passaggi 7-9 per ciascun embrione da iniettare e elettroporate. Io di solito electroporate embrioni 4-8 per la madre, a seconda della quantità di DNA, il numero di embrioni, la condizione di madre, e la quantità di tempo sotto anestesia. In alternativa, gli embrioni multipli possono essere iniettati e poi elettroporate, in contrasto con l'iniezione e electroporating ogni embrione separatamente. Dopo electroporating gli embrioni, usare il forcipe e spatola per sostituire la catena embrionale indietro nella cavità addominale. Versare circa 2 ml di antibiotico-antimicotico soluzione nella cavità addominale. Utilizzare il hemostat e pinze a suturare il peritoneo, a partire da un doppio nodo sulla parte anteriore della incisione e procedere con un disegno semplice sutura continua alla parte posteriore della incisione. Utilizzare il ciclo finale per legare la sutura e tagliare l'eccesso di sutura. Per l'incisione di base chiusi, sollevare la cute nella porzione anteriore della ferita con una pinza smussato, facendo attenzione a separare la pelle dal peritoneo. Mettere i denti della cucitrice intorno la pelle e deprimono la cucitrice. Continua l'incisione pinzatura chiuso fino alla fine posteriore, che normalmente richiede punti 5-7. Pulire la ferita intorno al graffette con un tampone di alcool. Lasciate che la madre di recuperare sul pad di riscaldamento (di solito prende tra 15-90 minuti per lei per risvegliare) e quando lei inizia a rotolare, il suo posto in un lato della gabbia nuova addominale alto. Per ridurre al minimo il dolore e il disagio, le madri ricevono buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg, sc) al risveglio, e in momenti successivi, se il disturbo continua. Per prevenire la disidratazione, iniettare la madre con 1,0 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea (sc) ~ 2-4 ore post-operatorie, e di nuovo se la sera e il giorno successivo se necessario. 24 ore dopo la chirurgia, la madre dovrebbe riacquistare un comportamento normale e da bere e mangiare regolarmente. Parte 2B: In recupero elettroporazione utero della retina di retina elettroporate a E18.5 Preparare 4% paraformaldeide (PFA) in PBS, rendendo ~ 5 ml per embrione. Perfusione può essere fatto con una gravità basato su sistema di infusione o pompa a siringa. (In alternativa, E18.5 teste può essere semplicemente immersi nel 4% PFA durante la notte.) Iniettare la madre con0,2 ml di anestetico mix ip e garantire che essa sia completamente sotto anestesia. Utilizzare un paio di forbici per tagliare la pelle e peritoneo sotto le graffette per esporre la cavità addominale e le corna uterine. Rimuovere un embrione elettroporate e pin up che lato ventrale. Tagliare le porzioni di pelle addominale, peritoneo, membrana e laterale della gabbia toracica per esporre il cuore. Pierce il ventricolo sinistro con l'ago a farfalla collegata al setup perfusione, e tagliare l'atrio destro con un microscissors. Avviare la perfusione e consentire PFA di flusso per ~ 60 secondi; sangue dovrebbe uscire l'atrio destro e l'embrione dovrebbe diventare chiaro se la perfusione è successo. Decapitare l'embrione e raccogliere la testa nel 4% PFA in 15 ml fiala conica. Ripetere questa procedura per tutti gli embrioni elettroporate. Tenere testa nel 4% PFA notte a 4 ° C, e poi lavare in PBS per diversi giorni. Euthanize madre tramite dislocazione cervicale, quando tutti gli embrioni sono stati raccolti. Rimozione retina Dopo lavaggi PBS, perno la testa in un piatto dissezione con la retina verso l'alto e immergerli in PBS. Togliere la pelle di tutto il retina per rivelare la RPE. Utilizzando un 26G1 / 2 ago, forare la retina ventrale alla lente RPE-giunzione. Inserire un bordo di un microscissors in questo foro e fare un incisione verticale attraverso la retina ventrale al disco ottico. Questo vi permetterà di orientare la retina quando la si rimuove. Rimuovere il RPE con punta fine pinze. Afferra il RPE alla incisione ventrale con una pinza e utilizzare pinze altri sbucciare la RPE lontano dalla retina, in particolare al RPE-lente bivio dove la RPE sia ben inserito. Dopo aver rimosso l'RPE, afferrare la lente con una pinza sottile e tirare su e via per eliminare l'obiettivo. Rimuovere retina mettendo forcipe intorno alla testa del nervo ottico e un pizzico fuori retina. Trasferimento retina ad un PBS pieno di bene, tenere traccia delle retine che è venuto da cui teste. Ripetere i passaggi 4-5 per la retina controlaterale, e per tutti gli altri embrioni elettroporate. Il non-iniettati retina funge da controllo per immunocolorazione. Utilizzare un microscopio a fluorescenza dissezione per la scansione di tutti retina per GFP + cellule (verde retina). Per tutti GFP + retina, l'elettroporazione ha avuto successo in questo embrione, e questi retina e cervello corrispondente (con il sistema visivo intatto) possono essere utilizzati per ulteriori analisi (cioè sezionamento e immunostaining) (Figura 1). 3a parte: elettroporazione in vivo della retina Ex iniezione e electroporating DNA in E14.5 retina murini in vitro Anestetizzare una madre-E13.5 E14.5 palco con 0,2 ml di mix di anestetico e garantire che essa sia completamente sotto anestesia. Usare le forbici per tagliare la pelle e cavità addominale per esporre embrioni. Sollevare catena embrionale con una pinza e tagliare il tessuto connettivo per rimuovere completamente tutta la catena embrionale dalla madre. Luogo catena embrionale in una capsula di Petri con DMEM/F12 sul ghiaccio. Euthanize madre tramite dislocazione cervicale. Tagliare l'intera parete uterina con un microscissors. Quindi utilizzare pinze per rimuovere ogni embrione dal sacco amniotico e la placenta pizzico off. Decapitare ogni embrione e raccogliere le teste in un altro piatto di Petri con DMEM/F12 sul ghiaccio. Utilizzando pipetta bocca o una pipetta a stantuffo, riempire micropipetta con quantità desiderata di soluzione di DNA (vedere la Parte 1). In questo protocollo, il DNA sarà iniettato nella retina periferica dorsale. Si può bersaglio altre regioni della retina regolando il sito di iniezione del DNA e il posizionamento delle pale degli elettrodi. Trasferire una testa di piatto dissezione con PBS e pin lato dorsale testa. Usare pinze per rimuovere la pelle sopra retina. Tenendo il micropipetta ~ 10 ° dalla posizione orizzontale (essenzialmente parallelo alla curvatura della retina dorsale), spingere micropipetta attraverso l'RPE in modo che la punta è tra le RPE e strato esterno della retina. Espellere ~ 0,1-0,4 ul di soluzione di DNA in questo spazio; liquido verde dovrebbe essere osservabile riempire tutto lo spazio e la fuoriuscita attraverso il foro di RPE. Ripetere l'iniezione per la retina controlaterale. Con attenzione, ma rapidamente rimuovere i perni e (tenendo testa immersa in PBS) pagaie posto elettrodo intorno alla testa, con il polo positivo (+) con pale al lato ventrale della testa. Offrire 4 40-V, 50 impulsi ms a 60 Hz, poi posto la testa di nuovo in un piatto con DMEM/F12 su ghiaccio (Figura 2). Ripetere i passaggi 5-7 per tutte le teste e per tutte le soluzioni del DNA. Dopo aver completato electroporations, aggiungere circa 1,5 ml di soluzione SFM ossigenata a un 4-ben piatto e tenere in ghiaccio (un bene per ogni soluzione di DNA diversa iniettata). Trasferire una testa un piatto con dissezione DMEM/F12, con una retina verso l'alto. Sulla retina ventrale (o regione bersaglio lato opposto), utilizzare una pinza sottile a pizzicoe un buco nel RPE. Inserire una delle estremità della pinza attraverso questo foro per sbucciare la RPE lontano dalla retina, in particolare presso la lente-retina di giunzione. Non tagliare o danneggiare la retina, perché questo farà sì che retina a collassare su se stesso durante l'incubazione. Dopo aver rimosso RPE, l'uso di forcipe saltar fuori retina pizzicando nervo ottico alla base della retina (lasciare intatta la lente). Trasferimento retina per SFM ossigenato. Capovolgere la testa e ripetere per l'occhio controlaterale. Completa il passaggio 9 per tutte le teste elettroporate. Incubare retina in SFM ossigenata a 37 ° C per 40-48 ore. 3b parte: Ex raccolta elettroporazione in vivo della retina e la placcatura di GFP + espianti di retina (2 giorni post-elettroporazione) Trasferire tutte le retine da un pozzo di SFM ossigenata in un coperchio Petri con DMEM/F12. Selezionare una retina e l'uso fluorescenti portata dissezione di visualizzare GFP + (verde) porzione di retina. Utilizzando un microscalpel e pinze, sezionare e scartare la non-GFP + porzione di retina in modo che solo una GFP + pezzo di retina rimane. E 'utile per passare continuamente tra la luce fluorescente e regolari durante la dissezione per selezionare specificamente la GFP + retina. Trasferire la GFP + retina di un pozzo con DMEM/F12. Ripetere il passaggio 2 per tutti i retina da un pozzetto. Per ogni condizione di DNA (ognuna ben diversa), utilizzare un nuovo piatto di Petri e DMEM/F12 media. Queste GFP + retina deve ora essere sezionato in piccoli espianti di retina per la placcatura. In un ambito di dissezione, taglio grosso pezzo di retina GFP + in piccoli espianti con un microscalpel. Espianti deve essere rettangolare, ~ 200-300 micron di lunghezza e larghezza. Raccogliere tutti espianti in un pozzo con DMEM/F12. Un GFP + porzione di retina dovrebbe produrre ~ 4-10 GFP + espianti di retina a seconda delle dimensioni del tessuto. Ripetere questo passaggio per tutti GFP + regioni della retina che sono state raccolte. Dopo aver preparato tutti GFP + espianti di retina, aggiungere 250 microlitri di SFM + 0,4% di metilcellulosa (conservato a 4 ° C) per laminina rivestite piatti di cultura (vedi Parte 1). Trasferimento 4-8 GFP + espianti al piatto cultura e usare il forcipe per organizzare delicatamente il espianti in un poligono, con espianti a metà strada tra il centro e il bordo del piatto. Determinare quale lato del espianto è lo strato RGC. A volte i cristalli RPE rimanere attaccato allo strato esterno della retina, che indica che il lato opposto è lo strato RGC. Inoltre, il lato RGC di solito ha alcuni detriti cellulari che possono aiutare con l'orientamento corretto espianto. Con il livello RGC verso il basso, utilizzare pinze a deprimere saldamente al centro della espianto in modo che possa aderire al coprioggetto di vetro. Una rientranza nel espianto dal forcipe può essere visibile, questo è normale. Dopo placcatura tutti espianti su un piatto cultura, trasferire in un incubatore a 37 ° C. Assoni della retina sono in primo luogo osservato 4-6 ore dopo la placcatura e espianti rimanere sani per diversi giorni, ma significativa crescita eccessiva può verificarsi dopo 24 ore. Espianti possono essere utilizzati per numerose prove in vitro, fissate con PFA 4% per 30 minuti e immunoistochimica (Figura 2). Saggio di confine In alternativa, il trasferimento di 4 GFP + espianti a un piatto che è stato preparato per il saggio di confine (vedi parte 1). Disporre le espianti in una linea verticale al centro del piatto, approssimando la posizione del confine. Sotto un microscopio a fluorescenza dissezione, la piastra di espianti in modo che siano ~ 50-150 mm dal bordo fluorescente. Incubare i piatti a 37 ° C per 24 ore, dando il tempo sufficiente per raggiungere gli assoni RGC substrato di confine. Espianti possono essere fissate in 4% PFA per 30 minuti, seguita da immunocolorazione (Figura 2). Rappresentante risultati