מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק
Summary
פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה Ca<sup> 2 +</sup> הדמיה של שריר חלק בתוך איברים מבודדים, לרבות: הכנת הרכישה, תמונה רקמות וניתוח נתונים.
Abstract
Ca 2 + הדמיה של שריר חלק מספק תובנה מנגנוני הסלולר כי לא עלולה לגרום לשינויים של פוטנציאל הממברנה, כמו שחרורו של Ca 2 + מחנויות פנימי, ומאפשר מספר תאים בו זמנית כדי להיות במעקב על מנת להעריך, למשל, צימוד סינסיציאלי רקמות. Subcellular Ca 2 + הארעיים נפוצים שריר חלק, אך קשה למדוד במדויק בגלל הבעיות שנגרמות על ידי התרחשות סטוכסטיים שלהם, על פני שדה רחב של נוף לעתים קרובות, באיבר שהוא נוטה להתכווץ. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו סדרה של פרוטוקולים הדמיה רוטינות ניתוח לרכוש ולאחר מכן לנתח, באופן אוטומטי, את תדירות, מיקום משרעת של אירועים כאלה. בעוד גישה זו ניתן להחיל בהקשרים אחרים, העבודה שלנו כרוך זיהוי של המקומיים purinergic Ca 2 + הארעיים לאיתור לשחרר משדר עם רזולוציה submicron.
ה-ATP משוחרר כמו cotransmitter מן העצבים האוטונומית, שם הוא נקשר לקולטנים P2X1 על השריר החלק של detrusor ואת הזרע הזרע. Ca 2 + מזין את השרירים החלקים, וכתוצאה מכך purinergic neuroeffector Ca 2 + הארעיים (NCTs). מוקד Ca 2 + הארעיים לאפשר ניטור אופטי של שחרור הנוירוטרנסמיטר באופן יש יתרונות רבים על electrophysiology. מלבד ההחלטה מרחבית השתפרו מאוד, הקלטה אופטי יש יתרון נוסף המאפשר הקלטה של שחרור משדר להבדיל מאתרים רבים בו זמנית. יתר על כן, מטוס אופטי של המוקד הוא קל יותר לתחזק או לתקן במהלך סדרת הקלטה ארוך יותר הוא מחדש של microelectrode חד תאיים.
לסיכום, שיטת הדמיה של Ca 2 + הקרינה מתוארת בו פרטים הכנת הרקמה, ורכישת וניתוח של נתונים. אנו המתאר את השימוש של מספר תסריטים לניתוח כזה Ca 2 + הארעיים.
Protocol
Discussion
הבחירה של פלורסנט Ca 2 + אינדיקטור
אורגון גרין 488 BAPTA-01:00 נבחר Ca 2 + אינדיקטור כי (i) הוא בהיר לעומת אינדיקטורים אחרים (למשל Fluo-4 ו הירוק סידן) 1 (ii) הוא רגיש לשינויים פיזיולוגיים ריכוז Ca 2 + עם ד K בסדר גודל דומה 1 אל תאיים Ca 2 + בריכוז [Ca 2 +] i (למשל של מוליכי הזרע 2) (iii) המון תאים רבים שריר חלק, מה שמאפשר לתא השריר החלק צימוד להיות במעקב. עם זאת, אורגון גרין 488 BAPTA-01:00 הוא לא ratioable Ca 2 + אינדיקטור, וככזה לא יכול בקלות לשמש כדי לקבוע המוחלט [Ca 2 +] אני. יתר על כן, היא עשויה גם חיץ Ca 2 + אם בריכוזים גבוהים הופך רווי שינויים משרעת גבוהה [Ca 2 +] אני.
עיכוב של contractility ספונטני
Contractility ספונטנית של איברים שריר חלק עשוי להיות מופחת פרמקולוגית, כגון על ידי חסימת התנועה של Ca 2 + דרך סוג L-Ca 2 + ערוצי (למשל על ידי: nifedipine 3; diltiazem 4). שים לב כי תרופות אלו יהיה לצמצם במידה ניכרת את המשרעת של כל תא Ca 2 + גלי / הארעיים.
התכווצות של הזרע הזרע נובע משילוב של עצבית purinergic בעיקר noradrenergic. מיקוד Ca 2 + הארעיים ברקמה זו, עם זאת, רגישות המצור קולטן noradrenergic (למשל α 1 adrenoceptor, על ידי prazosin 5), כך התנועה עשוי להיות מופחת מבלי להשפיע על מוקדי Ca 2 + הארעיים.
לחילופין, ניתן למנוע התכווצות 'במורד הזרם' דרך עיכוב של שרירן למשל שרשרת אור קינאז ידי wortmannin 6.
מסקנות
ניטור Ca 2 + הקרינה בבית submicron רזולוציה היא טכניקה רבת עוצמה כדי לחקור את הפוסט junctional ההשפעות של שחרור הנוירוטרנסמיטר 5,7 ו שחרורו של Ca 2 + מחנויות פנימיים (למשל "ניצוצות" 8). הניתוח של Ca 2 + הארעיים באמצעות מתודולוגיה המפורטים כאן היא חסכונית בהשוואה, זמין מסחרית חבילות ניתוח התמונה ומאפשר תפורים אישית באמצעות ניתוח בכתב plugins Java עבור ImageJ.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
האמון Wellcome סיפקה תמיכה כספית (פרס VIP כדי JSY ואת 074,128 עמיתי מחקר כדי KLB). המועצה למחקר רפואי מלגת הלימודים כדי RJA
Leica_SP2_Stacker, אלגוריתם המשמש לייבוא המריבות על "שחזור" לסדרה, המבוססת על Leica_tiff_sequence, תוסף לקריאה לייקה SP2 המריבות בתוך ImageJ, שפותחה על ידי טוני קולינס בשימוש באישורו שלו.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg ו TurboReg, אלגוריתמים המשמשים הנכון עבור התנועה של רקמות, המבוססים על ה 'venaz ועמיתיו (1998) 9.
Excel_writer.jar נכתב על ידי קורט דה ווס (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
JNCT0.08JoVE.ijm, אלגוריתם זיהוי החלקיקים, מבוסס על אלגוריתם שנכתב על ידי המוח KL ומפורט בעבר 5.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg | |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO | |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica | |||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport | M-VW-3046-OPT-012140 | ||
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
Riferimenti
- Haugland, R. P., Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).
- Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse. Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).
- Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. J Physiol. 150, 273-286 (2001).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 564, 201-212 (2005).
- Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens. J. Physiol. 541, 849-862 (2002).
- Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).
- Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder. J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).
- Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, 633-637 (1995).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).
