تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء
Summary
تفاصيل أساليب عالية الدقة كا<sup> 2 +</sup> التصوير من العضلات الملساء داخل أجهزة معزولة ، ومنها : التحضير لاكتساب صورة من الأنسجة ، وتحليل البيانات.
Abstract
كاليفورنيا 2 + التصوير من العضلات الملساء ، رؤية ثاقبة الآليات الخلوية التي قد لا تسفر عن تغييرات محتملة في الغشاء ، مثل الافراج عن كا 2 + من مخازن الداخلية ، ويسمح لخلايا متعددة في وقت واحد يمكن رصدها لتقييم ، على سبيل المثال ، في اقتران المخلوي الأنسجة. التحت خلوية كا 2 + العابرين شائعة في العضلات الملساء ، ولكن يصعب قياسها بدقة بسبب المشاكل الناجمة عن وقوعها العشوائية ، أكثر من حقل واسع في كثير من الأحيان من العرض ، في الجهاز الذي يجعله عرضة للتعاقد. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير سلسلة من البروتوكولات والتصوير الروتينية للحصول على تحليل ومن ثم تحليلها ، وبطريقة آلية ، والتردد ، والموقع والسعة من مثل هذه الأحداث. بينما يمكن تطبيق هذا النهج في سياقات أخرى ، عملنا يشمل الكشف عن purinergic كا 2 + العابرين المحلية لتحديد مواقع اطلاق سراح الارسال مع القرار submicron.
ATP يتم تحريرها باعتبارها cotransmitter من الأعصاب اللاإرادية ، حيث يربط P2X1 المستقبلات في العضلات الملساء للالنافصة والأسهر. كاليفورنيا 2 + يدخل العضلات الملساء ، مما أدى إلى purinergic neuroeffector العابرين كا + 2 (NCTs). الاتصال كا 2 + العابرين تسمح برصد البصرية الإفراج العصبي بطريقة العديد من المزايا أكثر من الكهربية. وبصرف النظر عن القرار المكانية تحسنت كثيرا ، وتسجيل البصرية لديه ميزة إضافية تتمثل في السماح للتسجيل من مواقع الارسال الافراج مميزة كثيرة في وقت واحد. وعلاوة على ذلك ، فإن الطائرة الضوئية التركيز هو أسهل للحفاظ على أو تصحيح خلال سلسلة طويلة من تسجيل هو ضعيتها microelectrode an حادة داخل الخلايا.
باختصار ، هو وضع الخطوط العريضة لطريقة التصوير من كا 2 + مضان الذي تفاصيل إعداد الأنسجة ، واقتناء وتحليل البيانات. نحن مخطط استخدام البرامج النصية عدة لتحليل مثل الكالسيوم 2 + العابرين.
Protocol
Discussion
اختيار الفلورسنت كا 2 + مؤشر
أوريغون الخضراء BAPTA 488 – 1 حيث تم اختيار AM كا 2 + المؤشر لأنه (ط) هو مشرق مقارنة بالمؤشرات الأخرى (مثل Fluo – 4 والأخضر الكالسيوم) 1 ؛ تركيز + (ب) هو حساسية للتغيرات فسيولوجية في كا 2 مع د K حجم مماثل من 1 إلى داخل الخلايا كا 2 + تركيز [كا 2 +] ط (مثلا الأسهر 2) ، (الثالث) يحمل الكثير من خلايا العضلات الملساء ، مما السلس اقتران الخلايا العضلية ليتم رصدها. ومع ذلك ، ولاية أوريغون الخضراء BAPTA – 488 01:00 هو غير ratioable كا 2 + المؤشر ، ولا يمكن بسهولة مثل استخدامها لتحديد المطلق [كا 2 +] ط. وعلاوة على ذلك ، فإنه قد العازلة أيضا كا 2 + اذا كان حاضرا في تركيزات عالية وتصبح مشبعة مع التغيرات في السعة العالية [كا 2 +] ط.
تثبيط انقباض عفوية
قد يكون خفض انقباض عفوية الأجهزة العضلات الملساء عقاقيري ، مثل حظر حركة كا 2 + من خلال نوع L – كا 2 + قنوات (مثلا : النيفيديبين 3 ؛ ديلتيازيم 4). علما أن هذه الأدوية سوف يقلل كثيرا من سعة كامل الخلية كا 2 + ومضات / العابرين.
تقلص الأسهر النتائج من مزيج من النقل العصبي في المقام الأول وpurinergic noradrenergic. تنسيق كا 2 + العابرين في هذه الأنسجة ، ولكن ، حساسة للحصار مستقبلات noradrenergic (مثلا α 1 الأدرينية ، التي برازوسين 5) حتى يمكن تقليل الحركة دون أن يؤثر ذلك التنسيق كا 2 + العابرين.
بدلا من ذلك ، قد يتم منع الانكماش 'المصب' عن طريق تثبيط ضوء سلسلة الميوسين مثل كيناز بواسطة wortmannin 6.
الاستنتاجات
رصد كا 2 + مضان في القرار submicron هي تقنية قوية لدراسة آثار ما بعد الإفراج صلي 5،7 العصبي ، والإفراج عن كا 2 + من مخازن الداخلية (مثل "الشرارات" 8). تحليل كا 2 + العابرين باستخدام المنهجية المذكورة هنا هي فعالة من حيث التكلفة مقارنة المتاحة تجاريا حزم ويسمح تحليل الصور مصممة خصيصا من خلال تحليل الإضافات جافا مخصصة لكتابة ImageJ.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وفرت الدعم المالي ويلكوم ترست (جائزة لكبار الشخصيات وJSY 074128 زمالة بحوث لKLB). مجلس البحوث الطبية دراسية للRJA
ويستند Leica_SP2_Stacker ، خوارزمية تستخدم لاستيراد المشاجرات ل 'إعادة البناء' في سلسلة ، على Leica_tiff_sequence المساعد لايكا SP2 قراءة في ImageJ المشاجرات ، التي وضعها توني كولينز واستخدامها بإذنه.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg وTurboReg ، تستند الخوارزميات المستخدمة لتصحيح حركة الأنسجة ، وعلى venaz ث وزملاؤه (1998) 9.
وقد كتب Excel_writer.jar بواسطة كورت دي فوس (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
ويستند JNCT0.08JoVE.ijm ، الخوارزمية الكشف عن الجسيمات ، على خوارزمية كتبه الدماغ كوالا لمبور ومفصلة من قبل 5.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg | |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO | |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica | |||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport | M-VW-3046-OPT-012140 | ||
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
Riferimenti
- Haugland, R. P., Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).
- Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse. Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).
- Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. J Physiol. 150, 273-286 (2001).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 564, 201-212 (2005).
- Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens. J. Physiol. 541, 849-862 (2002).
- Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).
- Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder. J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).
- Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, 633-637 (1995).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).
