Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l'analisi dei contenuti elevati di neurotossicità
Summary
Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.
Abstract
Alta Content Analysis (HCA) saggi combinano le cellule e reagenti di rilevamento automatico e con immagini potenti algoritmi di analisi delle immagini, consente la misurazione di diversi fenotipi cellulari all'interno di un singolo test. In questo studio, abbiamo utilizzato HCA per sviluppare un nuovo metodo di analisi di neurotossicità. Neurotossicità di valutazione rappresenta una parte importante della valutazione sulla sicurezza dei farmaci, oltre ad essere un focus significativo degli sforzi di protezione ambientale. Inoltre, la neurotossicità è anche ben accettato<em> In vitro</emMarker> dello sviluppo di malattie neurodegenerative come l'Alzheimer e di Parkinson. Recentemente, l'applicazione di HCA allo screening neuronale è stata riportata. Mediante l'etichettatura cellule neuronali con βIII-tubulina, saggi di HCA in grado di fornire high-throughput, non soggettivo, misurazioni quantitative dei parametri quali il numero dei neuroni, il conteggio dei neuriti e la lunghezza dei neuriti, che può indicare effetti neurotossici. Tuttavia, il ruolo degli astrociti rimane inesplorato in questi modelli. Astrociti ha un ruolo fondamentale nel mantenimento del sistema nervoso centrale (SNC) omeostasi, e sono associati con entrambi neuroprotezione e neurodegradation quando sono attivati in risposta a sostanze tossiche o stati di malattia. GFAP è una proteina filamenti intermedi espressi prevalentemente astrociti del sistema nervoso centrale. Attivazione degli astrociti (gliosi) porta alla upregulation di GFAP, comunemente accompagnato da proliferazione degli astrociti e ipertrofia. Questo processo di gliosi reattiva è stata proposta come marker precoce di danni al sistema nervoso. Il metodo tradizionale per la quantificazione GFAP è da immunologico. Questo approccio è limitato dalla incapacità di fornire informazioni sulla localizzazione cellulare, la morfologia e il numero di cellulare. Abbiamo determinato che HCA potrebbero essere utilizzati per superare queste limitazioni e per misurare simultaneamente molteplici funzionalità associate a gliosi – cambiamenti nell'espressione GFAP, ipertrofia astrociti, e la proliferazione degli astrociti – all'interno di un singolo test. In co-coltura studi, gli astrociti hanno dimostrato di proteggere i neuroni contro diversi tipi di insulto tossico e di influenzare in modo critico la sopravvivenza neuronale. Recenti studi hanno suggerito che l'uso di astrociti in<em> In vitro</emNeurotossicità> sistema di test possono rivelarsi più rilevanti per la struttura umana SNC e la funzione di cellule neuronali da solo. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un saggio HCA per co-coltura di neuroni e astrociti, composto di protocolli e validati, target-specifici reagenti di rilevamento per il profiling βIII-tubulina e proteina acida gliale fibrillare (GFAP). Questo test consente l'analisi simultanea di neurotossicità, crescita dei neuriti, gliosi, morfologia neuronale e astrociti e lo sviluppo neuronale e astrociti in una vasta gamma di modelli cellulari, che rappresentano un romanzo, non soggettivo, high-throughput test per la valutazione neurotossicità. Il saggio ha un grande potenziale per il rilevamento di neurotossicità maggiore e una migliore produttività della ricerca nel campo delle neuroscienze e la scoperta della droga.
Protocol
Discussion
Fino ad oggi, di esperimenti in vitro progettato per studiare la valutazione del rischio di neurotossicità utilizzando colture miste di neuroni e astrociti sono stati limitati. E 'ben accettato che le cellule gliali sono parte integrante nel fornire supporto spaziale e metabolico ai neuroni, e svolgono un ruolo cruciale nel modulare diverse funzioni neuronali, compresa la migrazione neuronale, la differenziazione e l'attività sinaptica. Astrociti gliali anche rilascio di citochine e altri fattori solubili, che sono in grado di indurre sia tolleranza effetti avversi su tessuti circostanti neuronale, oltre a promuovere neuronale di molte tossine. Dimostrare la profondità dei neuroni-gliali interazioni, in co-coltura studi, gli astrociti hanno dimostrato di proteggere i neuroni contro la tossicità di stress ossidativo, mentre l'alterazione delle funzioni astrociti, come la manutenzione di difesa antiossidante ed i livelli di energia cellulare, è stato dimostrato che criticamente influenzano la sopravvivenza neuronale. Recenti studi hanno suggerito che l'uso di astrociti in una neurotossicità in vitro di test del sistema può rivelarsi più rilevanti per la salute umana struttura del sistema nervoso centrale e la funzione di cellule neuronali da solo. Nonostante la crescente consapevolezza del significato fisiologico di neuroni, astrociti interazioni, è già stato difficile effettuare analisi quantitative di queste interazioni in cellule intatte. L'avvento di screening ad alta Contenuto consente lo sviluppo di potenti nuove analisi per affrontare questo.
In questo studio, abbiamo dimostrato che le analisi quantitative di più fenotipi neuronali e astrociti all'interno di un singolo test sono rese possibili da HCA. Nei neuroni primari abbiamo effettuato misurazioni quantitative dei marcatori di neurotossicità quali il numero dei neuroni, il conteggio dei neuriti e la lunghezza dei neuriti. Negli astrociti, gliosi reattiva è un biomarker noto di neurotossicità, caratterizzata da alterazioni nell'espressione GFAP, il numero di astrociti e la morfologia degli astrociti. Abbiamo dimostrato che ognuno di questi endpoint possono facilmente essere valutata tramite HCA. Questi studi supportano il concetto che HCA di neurali specifici biomarcatori potrebbe essere utilizzato come parte di una batteria di test in vitro per lo screening rapidamente un gran numero di sostanze chimiche per gli endpoint neurotossici.
Millipore HCS222 Alta kit Content Analysis per co-coltura di neuroni e astrociti si compone di alta qualità, reagenti e protocolli per il rilevamento simultaneo profilazione βIII-tubulina e proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) in una vasta gamma di modelli cellulari di neurotossicità. La altamente convalidato reagenti forniti con questo kit consentono all'utente di standardizzare i test, ridurre al minimo dosaggio a dosaggio variabilità, riproducibile e per generare immagini con un elevato rapporto segnale-background rapporto.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Drs. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matteo Hsu, Jehangir Mistry e Michele Hatler per il supporto durante lo sviluppo di questi progetti e protocolli.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
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| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
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| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
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| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
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| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
| HCS imaging/analysis system |
Riferimenti
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