Summary

Interférence de l’ARN larvaire chez le ver à soie Bombyx mori par l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb

Published: October 04, 2024
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Summary

Voici un protocole pour l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb dans les larves de ver à soie Bombyx mori afin d’induire le silençage génique par ingestion.

Abstract

Le ver à soie, Bombyx mori, est un insecte économique important avec des milliers d’années d’histoire en Chine. Pendant ce temps, le ver à soie est l’insecte modèle des Lépidoptères avec une bonne accumulation de recherche fondamentale. C’est également le premier insecte chez les lépidoptères dont le génome complet a été séquencé et assemblé, ce qui fournit une base solide pour l’étude de la fonction génétique. Bien que l’interférence ARN (ARNi) soit largement utilisée dans l’étude fonctionnelle des gènes inverses, elle est réfractaire chez les vers à soie et d’autres espèces de lépidoptères. Des recherches antérieures réussies sur l’ARNi pour délivrer de l’ARN double brin (ARNdb) ont été réalisées par injection uniquement. L’administration d’ARNdb par l’alimentation n’est jamais rapportée. Dans cet article, nous décrivons les procédures étape par étape pour préparer les nanoparticules de chitosane/ARNdb, qui sont données aux larves de ver à soie par ingestion. Le protocole comprend (i) la sélection du stade approprié des larves de vers à soie, (ii) la synthèse de l’ARNdb, (iii) la préparation des nanoparticules de chitosane/ARNdb, et (iv) l’alimentation des larves de vers à soie avec des nanoparticules de chitosane/ARNdb. Des résultats représentatifs, y compris la confirmation du transcrit du gène et l’observation du phénotype, sont présentés. L’alimentation par ARNdb est une technique simple pour l’ARNi chez les larves de vers à soie. Étant donné que les larves de vers à soie sont faciles à élever et assez grandes pour être utilisées, il s’agit d’un bon modèle pour démontrer l’ARNi larvaire chez les insectes. De plus, la simplicité de cette technique stimule une plus grande implication des étudiants dans la recherche, ce qui fait des larves de vers à soie un système génétique idéal pour une utilisation en classe.

Introduction

Le ver à soie, Bombyx mori, est un insecte domestiqué il y a plus de 5000 ans en Chine. En raison de sa capacité à produire de la soie, le ver à soie est un insecte économique important dans l’agriculture et la sériciculture chinoises. Le ver à soie est le deuxième insecte modèle après la mouche des fruits. En tant qu’insecte modèle chez les lépidoptères, le ver à soie est facile à élever, avec une grande taille et de nombreux mutants. Pendant ce temps, le ver à soie est le premier insecte lépidoptère dont le génome complet a été séquencé1. De nombreuses bases de données fournissant des informations sur le génome2, le transcriptome3, l’étiquette de séquence exprimée (EST)4, l’ARN non codant5 et le microsatellite6 sont également accessibles au public. Les faits ci-dessus font du ver à soie un modèle parfait pour la recherche génétique.

L’interférence ARN (ARNi) est un processus cellulaire dans lequel les molécules d’ARN double brin (ARNdb) se lient et tranchent l’ARN messager complémentaire (ARNm), obtenant ainsi l’effet de silençage du gène cible. Ce mécanisme est naturellement présent chez les bactéries pour se défendre contre l’invasion des virus7. Plus tard, il a été découvert que l’ARNi est conservé chez les animaux, les plantes et les microbes. En raison de son puissant effet de silençage spécifique à la séquence, l’ARNi est utilisé dans la recherche fondamentale pour manipuler l’expression des gènes et étudier la fonction des gènes. L’ARNi est obtenu par l’administration d’ARNdb dans les cellules.

Chez les insectes, il existe trois façons courantes d’administrer l’ARNdb, à savoir la microinjection, l’alimentation et le trempage8. À l’heure actuelle, les rapports réussis d’ARNi dans les vers à soie par l’administration d’ARNdb nu sont effectués par injection d’ARNdb9. Les avantages de la micro-injection sont l’administration immédiate de l’ARNdb dans l’hémolymphe et le contrôle précis de la quantité d’ARNdb. Cependant, certains inconvénients de la micro-injection existent également. Par exemple, cela prend du temps et nécessite des appareils délicats. Il est également important d’optimiser les aiguilles d’injection, le volume d’injection et la quantité d’ARNdb. Par conséquent, une autre façon de transmettre l’ARNdb aux vers à soie devient nécessaire. Parce que l’exosquelette d’un insecte est une barrière étanche faite de chitine, le trempage des larves d’insectes pour obtenir de l’ARNi est rarement signalé, ce qui n’est pas une bonne option pour l’ARNi chez les insectes. L’alimentation en ARNdb est économique en main-d’œuvre, rentable et facile à réaliser10. Cette méthode est également applicable pour le criblage de gènes à haut débit11. Cependant, il a été constaté qu’une nucléase non spécifique de l’ADN/ARN, à savoir la BmdsRNase, est présente dans l’intestin moyen et le jus de l’intestin moyen des larves de ver à soie12. Il est démontré que cette nucléase digère l’ARNdb, de préférence13. Par conséquent, il semble difficile de donner de l’ARNdb nu au ver à soie pour réduire au silence l’expression des gènes.

Récemment, l’ARNdb protégé par des nanoparticules s’est avéré être une bonne alternative pour augmenter l’efficacité de l’ARNi en nourrissant14. Le chitosane est un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, qui peut être préparé par désacétylation de la chitine, un biopolymère naturel et le deuxième biopolymère le plus abondant après la cellulose15. Parce que le groupe amino dans le chitosane est chargé positivement et que le groupe phosphate sur le squelette de l’ARNdb est chargé négativement, les nanoparticules de chitosane/ARNdb pourraient être formées par auto-assemblage de polycations16. Les nanoparticules de chitosane/ARNdb sont efficaces pour obtenir de l’ARNi par l’alimentation des larves chez les moustiques Aedes aegypti et Anopheles gambiae17, le ver de la capsule à taches de coton Earias vittella18 et l’araignée carmin Tetranychus cinnabarinus19.

Afin de développer une méthodologie pour l’administration de l’ARNdb en se nourrissant des vers à soie pour obtenir une efficacité réussie de l’ARNi, ce rapport se concentre sur la description des procédures étape par étape sur la façon de préparer les nanoparticules de chitosan/ARNdb et de nourrir les larves de vers à soie avec les nanoparticules. Cette méthodologie est relativement peu coûteuse, économique en main-d’œuvre et facile à suivre, qui peut être adaptée pour des études de silençage génique chez d’autres insectes. Notre objectif est de fournir un protocole plus facile pour la méthode d’administration de l’ARNdb des lépidoptères avec une efficacité ARNi plus élevée.

Protocol

1. Espèces de vers à soie et élevage Élevez au moins 120 larves de vers à soie du1er stade fraîchement écloses de la souche B. mori P50 avec des feuilles de mûrier fraîches à 25 ± 1 °C, photopériode 12 h Lumière :12 h Foncé et 75% ± 5% d’humidité relative. 2. Sélection des larves de vers à soie Choisissez le jour 1 des larves du 5e stade pour l’ex…

Representative Results

Pour évaluer l’efficacité de l’ARNi, un gène immunitaire ciblant BmToll9-2 a été choisi pour l’analyse. Le gène BmToll9-2 est bien caractérisé en laboratoire, et le silençage génique par injection d’ARNdb permet d’obtenir des larves plus légères et plus petites dans notre récente publication20. Pour confirmer l’efficacité de l’ARNi par ingestion à travers des nanoparticules de chitosane/ARNdb, des nanoparticules de ch…

Discussion

Un stade approprié est important pour l’observation du phénotype de l’ARNi, en fonction des gènes ciblés. Nos résultats préliminaires ont montré que Toll9-2 est impliqué dans la croissance du ver à soie. La taille et le poids des larves de vers à soie augmentent rapidement au 5e stade21. Par conséquent, les larves du 5e stade sont sélectionnées comme scène pour l’expérience d’alimentation en nanoparticules de chitosane/AR…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31501898), le Programme des sciences et de la technologie de Guangzhou (202102010465), le Projet de réforme de la qualité de l’enseignement et de l’enseignement de l’enseignement supérieur de Guangzhou (2022JXGG057) et le projet de recherche du Comité directeur des cours en ligne ouverts des universités provinciales du Guangdong (2022ZXKC381).

Materials

1.5 mL centrifuge tube Sangon F601620 for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette Eppendorf P13473G to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette Eppendorf Q12115G to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette Eppendorf P20777G to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette Eppendorf H19229E to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette Eppendorf H20588E to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Costar 3516 for silkworm rearing individually
Acetic acid Aladdin A116165 to make TAE
Agarose M BBI Life Sciences A610013 for agarose gel electrophosis
Analytical balance Sartorius BSA224S to weight ingredients
Centrifuge  Sartorius Centrisart A-14C to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan Sigma-Aldrich C3646 to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA Sangon A500895 to make TAE
Ethanol Aladdin E130059 to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer Siemens iQ300 to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix Promega M712 for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 for qRT-PCR reaction
Isopropanol  Aladdin I112011 for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer ThermoFisher One to determine the concentration of dsRNA
ph meter Sartorius  PB-10 to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit Sangon B518141 for PCR product purification
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate  Sigma-Aldrich 239313 to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System Promega P1700 for dsRNA synthesis
ThermoMixer Eppendorf C for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris Sangon A501492 to make TAE
Vortex  IKA Vortex 3 to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles

References

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Citer Cet Article
Liu, J., Yang, Q., Yang, Y., Lin, X. Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery. J. Vis. Exp. (212), e67360, doi:10.3791/67360 (2024).

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