Le protocole décrit la sélection de variétés de riz à l’amidon résistantes par conception à l’aide de technologies d’édition du génome de manière précise, efficace et techniquement simple.
Les approches conventionnelles de la sélection des cultures, qui reposent principalement sur des méthodes longues et laborieuses telles que l’hybridation traditionnelle et la sélection par mutation, se heurtent à des défis pour introduire efficacement des caractères ciblés et générer des populations végétales diversifiées. À l’inverse, l’émergence des technologies d’édition du génome a inauguré un changement de paradigme, permettant la manipulation précise et accélérée des génomes des plantes pour introduire intentionnellement les caractéristiques souhaitées. L’un des outils d’édition les plus répandus est le système CRISPR/Cas, qui a été utilisé par les chercheurs pour étudier d’importants problèmes liés à la biologie. Cependant, le flux de travail précis et efficace de l’édition du génome n’a pas été bien défini dans la sélection des cultures. Dans cette étude, nous avons démontré l’ensemble du processus de sélection de variétés de riz enrichies de niveaux élevés d’amidon résistant (RS), un trait fonctionnel qui joue un rôle crucial dans la prévention de maladies telles que le diabète et l’obésité. Le flux de travail comprenait plusieurs étapes clés, telles que la sélection du gène SBEIIb fonctionnel, la conception de l’ARN guide unique (ARNsg), la sélection d’un vecteur d’édition du génome approprié, la détermination de la méthode d’administration du vecteur, la réalisation d’une culture de tissus végétaux, le génotypage des mutations et l’analyse phénotypique. De plus, le calendrier nécessaire pour chaque étape du processus a été clairement démontré. Ce protocole permet non seulement de rationaliser le processus de sélection, mais aussi d’améliorer la précision et l’efficacité de l’introduction des caractères, accélérant ainsi le développement de variétés de riz fonctionnelles.
La sélection traditionnelle repose sur l’introduction de caractères dans les cultures ou sur la production de populations végétales suffisamment variées, ce qui nécessite une observation à long terme sur le terrain 1,2. En raison des limites de la sélection traditionnelle, la technologie d’édition de gènes a été développée, qui peut modifier avec précision le génome des cultures pour obtenir les caractéristiques souhaitées des populations végétales3. Le système d’édition de gènes le plus largement utilisé chez les plantes est CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonucléas), qui s’appuie sur une endonucléase programmable guidée par l’ARN pour créer des cassures double brin (DSB) ciblées dans l’ADN 4,5. Ces CDB sont ensuite réparés par les mécanismes naturels de réparation de l’ADN de la cellule 6,7, ce qui entraîne souvent l’introduction des modifications génétiques souhaitées. Bien que cette technologie ait été mise en œuvre dans diverses cultures, notamment le blé8, le maïs9, le soja10 et le riz11, elle est principalement utilisée pour révéler des problèmes biologiques. Par rapport à son application extensive dans l’élucidation des fonctions des gènes des plantes, la recherche sur l’application des technologies d’édition génomique à la sélection des cultures reste relativement rare12.
Le processus d’édition génomique des cultures suit généralement un flux de travail bien défini qui englobe plusieurs étapes clés13. La première étape consiste à identifier le gène ou la région génétique spécifique qui doit être modifié pour obtenir le caractère souhaité. Deuxièmement, une stratégie d’édition génomique est conçue, impliquant la sélection d’un système d’édition génomique approprié (par exemple, CRISPR-Cas9 ou CRISPR-Cas12) et la conception d’ARN guides spécifiques pour diriger l’endonucléase vers le site cible. Troisièmement, le système d’édition de gènes est ensuite incorporé dans un vecteur de livraison, qui est utilisé pour introduire la machinerie d’édition dans les cellules végétales. Ces vecteurs peuvent être des complexes d’ADN, d’ARN ou de ribonucléoprotéines (RNP). Par la suite, les vecteurs d’édition génomique sont délivrés dans les cellules végétales à l’aide de diverses méthodes, notamment la transformation médiée par Agrobacterium, le bombardement de particules ou l’électroporation. Immédiatement, les cellules végétales transformées sont cultivées dans des conditions appropriées pour générer des callosités génétiquement modifiées ou des tissus embryogènes. Ces tissus sont ensuite régénérés en plantes entières grâce à des techniques de culture tissulaire. Les plantes régénérées sont soumises à une caractérisation moléculaire rigoureuse afin de confirmer la présence des modifications génétiques souhaitées.
Un article précédent de Tsakirpaloglou et al.14 donne un aperçu général du processus d’édition génomique, de la conception vectorielle à la génération de semis modifiés, mais il ne se penche pas sur l’analyse détaillée des caractères spécifiques associés au gène ciblé, ni sur l’évaluation ultérieure des performances agronomiques ou la validation fonctionnelle des cultures modifiées. Nous sommes allés au-delà de la simple démonstration de la faisabilité de l’édition d’un gène dans le riz. Notre travail évalue de manière exhaustive l’impact de cette modification sur les caractéristiques biochimiques, moléculaires et agronomiques des lignées de riz modifiées. Cela inclut l’évaluation de la composition de l’amidon, un facteur critique influençant la qualité et la valeur nutritionnelle des grains, qui n’a pas été largement exploré dans les études précédentes sur l’édition génomique.
L’amidon de riz se compose généralement de ~20% d’amylose et de ~80% d’amylopectine15. SBEIIb est une enzyme essentielle à la synthèse de l’amylopectine et est exprimée dans l’endosperme16. L’inhibition d’OsSBEIIb par l’expression de l’ARN en épingle à cheveux (ARNi) et des microARN a augmenté la teneur en amidon résistant17,18. L’amidon résistant est un substrat d’amidon qui ne peut pas être digéré et absorbé dans l’intestin grêle, mais qui peut être décomposé en acides gras à chaîne courte et en gaz par certaines bactéries digestives dans les intestins. Comme il ne peut pas être décomposé rapidement, il a un indice glycémique inférieur à celui des autres amidons et ne provoque pas d’augmentation rapide de la glycémie dans un court laps de temps après avoir mangé, ce qui peut atténuer le diabète dans une certaine mesure dans l’alimentation19. De plus, l’amidon résistant a des fonctions plus physiologiques, telles que la réduction de la réponse à l’insuline, la régulation de la fonction intestinale, la prévention de l’accumulation de graisse, la facilitation du contrôle du poids et la promotion de l’absorption des ions minéraux. Par conséquent, il est largement recherché en tant que nouveau type de fibre alimentaire20.
Pour surmonter ces défis et utiliser avec succès les technologies d’édition génomique pour la sélection de variétés de riz fonctionnelles, nous avons affiné et optimisé les protocoles opérationnels dans le riz. Notre objectif a été d’analyser méticuleusement la conception des loci des gènes cibles, de sélectionner soigneusement les outils d’édition de gènes les plus appropriés et d’effectuer une analyse phénotypique rigoureuse tout au long du processus de sélection. Pour témoigner de la puissance et de l’efficacité de ces technologies, nous présentons une étude de cas mettant en évidence le développement rapide d’une variété de riz fonctionnelle enrichie d’amidon à haute résistance. Cet exemple souligne le potentiel de l’édition génomique dans l’accélération de la sélection du riz fonctionnel, remédiant ainsi à la pénurie actuelle de recherche dans ce domaine.
Dans le processus de construction de vecteurs knockdown basés sur CRISPR/Cas-SF01, une sélection méticuleuse d’ARN monoguide (ARNsg) est essentielle. Cela nécessite l’adoption de séquences qui présentent une efficacité de montage élevée avec un minimum d’effets hors cible. De plus, la synthèse des amorces de ciblage incorpore de courts oligos adaptateurs correspondant aux sites d’épissage du vecteur, assurant une intégration transparente. Notamment, contrairement aux …
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été soutenus par le financement des grands projets de sélection biologique (2023ZD04074).
2 x Taq Plus Master Mix II | Vazyme Biotech Co.,Ltd | P213 | Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes |
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio | Phyto Technology | D309 | |
AAM medium | Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd | M9051C | |
BsaI-HF | New england biolabs | R3535 | Bsa I enzyme digestion of the editing vector |
Carbenicillin antibiotics | Applygen | APC8250-5 | Selection medium, regeneration medium |
Casaminoacid | BBI-Life SciencesCorporation | A603060-0500 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
DH5α Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | DL1001 | E. coli competent cells |
D-Sorbitol | BBI-Life SciencesCorporation | A610491-0500 | |
EDTA,disodium salt,dihydrate | Diamond | A100105-0500 | CTAB buffer |
EHA105 Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | AC1010 | Agrobacterium competent cells |
FastPure Plasmid Mini Kit | Vazyme Biotech Co.,Ltd | REC01-100 | Plasmid isolated |
Hygromycin antibiotics | Yeasen | 60224ES | co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium |
Kanamycin antibiotics | Yeasen | 60206ES10 | Selection agrobacterium |
KOH | Macklin | P766798 | CTAB buffer |
L-Glutamine | Phyto Technology | G229 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
L-Proline | Phyto Technology | P698 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) | – | – | Japonica varieties for breeding RS rice |
Mill rice mechine | MARUMASU | MHR1500A | To produce white rice |
Murashige Skoog | Phyto Technology | M519 | Root medium, regeneration medium |
Myo-inositol | Phyto Technology | I703 | Regeneration medium |
NaCl | Macklin | S805275 | For YEP media |
NB Basal Medium | Phyto Technology | N492 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Peptone | Solarbio | LA8800 | For YEP media |
Phytogel | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S24793 | |
Pot | Midea group Co. | MB-5E86 | For cooking rice |
Refrigerator | Haier | BCD-170 | Storage the medium |
Resistant Starch Assay Kit | Megazyme | K-RSTAR | Measurement and analysis resistant starch |
Rifampicin antibiotics | Sigma | R3501-250MG | Selection agrobacterium |
Sodium hypochlorite solution | Macklin | S817439 | For seed sterilization |
Sucrose | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | B21647 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
T4 DNA Ligase | New england biolabs | M0202 | Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector |
The glucose monitor | Medical Equipment & Supply Co., Ltd | Xuetang 582 | Detection the blood glucose |
Tris-HCL | Macklin | T766494 | CTAB buffer |
Yeast Agar | Solarbio | LA1370 | For YEP media |
YEP media | – | – | Cultivation of Agrobacterium |