Cette étude présente une méthode pionnière pour quantifier les sous-ensembles de cellules tueuses naturelles utérines pendant la fenêtre d’implantation à l’aide de techniques avancées de coloration immunohistochimique par fluorescence multiplexée.
L’immunohistochimie (IHC) joue un rôle crucial dans la recherche biologique et le diagnostic clinique, car elle est la méthode la plus couramment utilisée pour identifier et visualiser les antigènes tissulaires. Cependant, les méthodes traditionnelles de coloration IHC ont des limites pour distinguer divers sous-types de cellules immunitaires. Ce défi a poussé les scientifiques à explorer de nouvelles technologies et méthodologies pour l’identification et la différenciation précises des sous-types de cellules immunitaires. Ces dernières années, l’IHC multiplex s’est imposée comme une solution, permettant la détection simultanée de plusieurs antigènes et leur visualisation au sein d’un même échantillon de tissu. Les cellules tueuses naturelles utérines (uNK) jouent un rôle central dans les processus de début de grossesse, notamment la décidualisation, le remodelage des artères spirales utérines et l’implantation d’embryons. Différents sous-types de cellules uNK présentent des fonctions différentes, ce qui leur permet de coordonner divers événements biologiques pour un développement embryonnaire et une grossesse réussis. Par conséquent, des recherches approfondies sur les sous-types de cellules uNK sont essentielles pour élucider les mécanismes de régulation immunitaire pendant la grossesse. De telles études fournissent des informations précieuses et de nouvelles approches pour traiter des conditions connexes telles que l’infertilité et l’échec reproductif récurrent. Cet article présente un protocole détaillé de coloration IHC multiplex pour étudier la densité de quatre sous-types de cellules uNK dans des échantillons d’endomètre pendant la fenêtre d’implantation (WOI). Le protocole comprend la préparation des échantillons, l’optimisation des marqueurs de sous-types, l’imagerie microscopique et l’analyse des données. Ce protocole de coloration IHC multiplexe offre une spécificité et une sensibilité élevées, permettant la détection simultanée de différents sous-types de cellules uNK, fournissant ainsi aux chercheurs un outil puissant pour explorer les subtilités et les mécanismes de la régulation immunitaire pendant la grossesse.
La première naissance vivante documentée après fécondation-transfert d’embryons in vitro (FIV-ET) a été signalée en 1978. Au cours des 40 dernières années, il y a eu une forte demande pour l’assistance de la FIV-ET parmi les couples infertiles1. En 2021, 238 126 patientes ont initié un total de 413 776 cycles de FIV aux États-Unis. Il s’agit d’une augmentation de 25 % par rapport aux 2 années précédentes et de 135 % par rapport à 20122. Cette augmentation est principalement attribuée à la prévalence croissante de l’infertilité et à la planification tardive de la grossesse. Les progrès des techniques de culture d’embryons et des protocoles de superovulation ont conduit à une augmentation du taux de naissances vivantes par cycle TE, atteignant 30 % à 50 % chez les femmes de moins de 40 ans et moins de 30 % chez les femmes de plus de 40 ans2. Cependant, malgré ces progrès, plus de la moitié des embryons transférés ne s’implantent toujours pas. L’échec répété de l’implantation, généralement défini comme un échec après trois tentatives consécutives ou plus de transfert d’embryons de haute qualité, touche 15 % des femmes qui subissent une FIV-ET3. Les couples atteints de RIF sont extrêmement vulnérables et plus enclins à subir des procédures coûteuses et inutiles qui peuvent les exposer à des risques excessifs4. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les causes du RIF et d’améliorer l’implantation embryonnaire pour améliorer le succès de la FIV-ET, en particulier pour les femmes atteintes de FIV. La préparation de l’endomètre est essentielle pour une implantation réussie de l’embryon. Ce processus est caractérisé par une accumulation importante de cellules tueuses naturelles utérines (uNK), qui passent de la constitution de 30 % des lymphocytes totaux de l’endomètre au cours de la phase médio-sécrétoire à 70 % à 80 % du décidua au début de la grossesse5. Notamment, les cellules uNK diffèrent des cellules NK périphériques, qui sont des lymphocytes cytotoxiques essentiels au système immunitaire inné pour provoquer la mort des cellules infectées par lyse ou apoptose. Bien que les fonctions exactes des cellules uNK ne soient pas encore entièrement comprises, plusieurs sources de preuves suggèrent qu’elles sont impliquées dans le remodelage de l’angiogenèse, l’invasion du trophoblaste et le développement fœtal6. L’association entre le pourcentage de cellules uNK par rapport aux cellules stromales et RIF a suscité beaucoup d’intérêt au cours des 20 dernières années. Une méta-analyse récente, qui comprenait 8 études portant sur 604 femmes, a démontré que la densité des cellules CD56+uNK pendant la phase lutéale moyenne est significativement augmentée chez les femmes atteintes de RIF par rapport aux témoins fertiles7. Cependant, il est important de noter que les caractéristiques des cellules uNK au cours de la phase lutéale moyenne diffèrent considérablement de celles des cellules NK déciduales (dNK). Bien que les cellules uNK puissent se différencier en divers sous-ensembles de cellules dNK après la grossesse, la mesure des cellules uNK seule ne représente pas avec précision les cellules dNK8. Les cellules uNK subissent une différenciation dynamique et jouent différents rôles dans le cycle menstruel et les processus de décidualisation, ce qui les rend plus complexes que ce qui peut être identifié par CD56 seul. Plusieurs marqueurs sont nécessaires pour obtenir une compréhension complète du comportement des cellules uNK pendant la préparation de l’endomètre. Notre étude récente a utilisé le séquençage de l’ARN unicellulaire pour identifier la diversité des cellules uNK tout au long des cycles menstruels. Les résultats, validés par cytométrie en flux, ont montré la présence de quatre sous-types distincts de cellules uNK, chacun présentant des changements dynamiques au cours du cycle menstruel9. L’analyse de l’enrichissement génétique et l’enrichissement fonctionnel de l’ontologie génétique indiquent que ces sous-ensembles uNK remplissent des fonctions différentes à différents stades de la menstruation. Néanmoins, la cytométrie en flux n’est pas universellement accessible dans les laboratoires cliniques, et le traitement immédiat du tissu endométrial frais pour la digestion enzymatique rend impossible la répétition des étapes expérimentales en cas d’erreur.
L’objectif de cette étude était donc d’étudier la mesure de ces quatre sous-populations de cellules NK à l’aide d’un test de coloration multiplexe, qui fournit une approche diagnostique plus pratique. Dans la coloration multiple, différents anticorps spécifiques contre chaque cible sont liés à différents marqueurs fluorophores qui émettent différentes longueurs d’onde de lumière lorsqu’ils sont excités par une longueur d’onde spécifique de lumière. Par rapport à la méthode traditionnelle de coloration IHC, cette méthode peut comparer quantitativement l’abondance relative et la distribution de plusieurs cibles dans un échantillon et fournir des informations sur l’interaction et la co-localisation de différentes cibles, ce qui nous permet d’identifier différents sous-types de cellules uNK. Cette approche permettra non seulement d’approfondir notre compréhension de la relation entre les cellules uNK et le RIF, mais aussi d’approfondir l’étude d’autres sous-populations de cellules immunitaires dans les maladies liées à l’endomètre.
L’implantation embryonnaire implique une interaction complexe entre l’embryon et l’endomètre. Le statut immunologique de l’homéostasie de l’endomètre joue un rôle central dans la détermination de la réceptivité de l’endomètre. Au cours de l’OIO, la population leucocytaire prédominante dans l’endomètre est constituée de cellules NK. Environ 90 % des cellules uNK présentent une expression élevée de CD56, mais ne contiennent pas de CD16. Cependant, un sous-ense…
The authors have nothing to disclose.
La présente étude a été financée par le Fonds pour la santé et la recherche médicale (10210956).
CD49a | Novus Biologicals | NBP2-76478 | Primary antibodies |
CD56 | Leica | NCL-L-CD56-504 | Primary antibodies |
CD16 | abcam | ab183354 | Primary antibodies |
CXCR4 | R&D | MAB172 | Primary antibodies |
Amplification diluent | Akoya Biosciences | FP1498 series | Fluorophore dilution buffer |
Antibody diluents | Akoya Biosciences | ARD1001EA | Dilute the antibody |
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x) | Akoya Biosciences | A6001/A9001 | Antigen retrieval solution |
inForm advanced image analysis software | Akoya Biosciences | inForm Tissue Finder Software 2.2.6 | Data analysis software |
Mantra Workstations | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
microwave | Akoya Biosciences | inverter | Microwave stripping |
TSA 520 | Akoya Biosciences | FP1487001K | Suitable tyramide-based fluorescent reagents |
TSA 620 | Akoya Biosciences | FP1495001K | Suitable tyramide-based fluorescent reagents |
TSA 650 | Akoya Biosciences | FP1496001K | Suitable tyramide-based fluorescent reagents |
TSA 570 | Akoya Biosciences | FP1488001K | Suitable tyramide-based fluorescent reagents |
Poly-L-lysine coated slides | Fisher Technologies | 120-550-15 | Slides for routine histological use |
PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibodies |
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium | ThemoFisher Science | 495802 | Installation |
Spectral DAPI | Akoya Biosciences | FP1490A | Nucleic acid staining |