Summary

Mesure de quatre sous-types de cellules NK utérines à l’aide d’une coloration immunohistochimique fluorescente multiplexée chez des femmes présentant des échecs d’implantation répétés

Published: October 25, 2024
doi:

Summary

Cette étude présente une méthode pionnière pour quantifier les sous-ensembles de cellules tueuses naturelles utérines pendant la fenêtre d’implantation à l’aide de techniques avancées de coloration immunohistochimique par fluorescence multiplexée.

Abstract

L’immunohistochimie (IHC) joue un rôle crucial dans la recherche biologique et le diagnostic clinique, car elle est la méthode la plus couramment utilisée pour identifier et visualiser les antigènes tissulaires. Cependant, les méthodes traditionnelles de coloration IHC ont des limites pour distinguer divers sous-types de cellules immunitaires. Ce défi a poussé les scientifiques à explorer de nouvelles technologies et méthodologies pour l’identification et la différenciation précises des sous-types de cellules immunitaires. Ces dernières années, l’IHC multiplex s’est imposée comme une solution, permettant la détection simultanée de plusieurs antigènes et leur visualisation au sein d’un même échantillon de tissu. Les cellules tueuses naturelles utérines (uNK) jouent un rôle central dans les processus de début de grossesse, notamment la décidualisation, le remodelage des artères spirales utérines et l’implantation d’embryons. Différents sous-types de cellules uNK présentent des fonctions différentes, ce qui leur permet de coordonner divers événements biologiques pour un développement embryonnaire et une grossesse réussis. Par conséquent, des recherches approfondies sur les sous-types de cellules uNK sont essentielles pour élucider les mécanismes de régulation immunitaire pendant la grossesse. De telles études fournissent des informations précieuses et de nouvelles approches pour traiter des conditions connexes telles que l’infertilité et l’échec reproductif récurrent. Cet article présente un protocole détaillé de coloration IHC multiplex pour étudier la densité de quatre sous-types de cellules uNK dans des échantillons d’endomètre pendant la fenêtre d’implantation (WOI). Le protocole comprend la préparation des échantillons, l’optimisation des marqueurs de sous-types, l’imagerie microscopique et l’analyse des données. Ce protocole de coloration IHC multiplexe offre une spécificité et une sensibilité élevées, permettant la détection simultanée de différents sous-types de cellules uNK, fournissant ainsi aux chercheurs un outil puissant pour explorer les subtilités et les mécanismes de la régulation immunitaire pendant la grossesse.

Introduction

La première naissance vivante documentée après fécondation-transfert d’embryons in vitro (FIV-ET) a été signalée en 1978. Au cours des 40 dernières années, il y a eu une forte demande pour l’assistance de la FIV-ET parmi les couples infertiles1. En 2021, 238 126 patientes ont initié un total de 413 776 cycles de FIV aux États-Unis. Il s’agit d’une augmentation de 25 % par rapport aux 2 années précédentes et de 135 % par rapport à 20122. Cette augmentation est principalement attribuée à la prévalence croissante de l’infertilité et à la planification tardive de la grossesse. Les progrès des techniques de culture d’embryons et des protocoles de superovulation ont conduit à une augmentation du taux de naissances vivantes par cycle TE, atteignant 30 % à 50 % chez les femmes de moins de 40 ans et moins de 30 % chez les femmes de plus de 40 ans2. Cependant, malgré ces progrès, plus de la moitié des embryons transférés ne s’implantent toujours pas. L’échec répété de l’implantation, généralement défini comme un échec après trois tentatives consécutives ou plus de transfert d’embryons de haute qualité, touche 15 % des femmes qui subissent une FIV-ET3. Les couples atteints de RIF sont extrêmement vulnérables et plus enclins à subir des procédures coûteuses et inutiles qui peuvent les exposer à des risques excessifs4. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les causes du RIF et d’améliorer l’implantation embryonnaire pour améliorer le succès de la FIV-ET, en particulier pour les femmes atteintes de FIV. La préparation de l’endomètre est essentielle pour une implantation réussie de l’embryon. Ce processus est caractérisé par une accumulation importante de cellules tueuses naturelles utérines (uNK), qui passent de la constitution de 30 % des lymphocytes totaux de l’endomètre au cours de la phase médio-sécrétoire à 70 % à 80 % du décidua au début de la grossesse5. Notamment, les cellules uNK diffèrent des cellules NK périphériques, qui sont des lymphocytes cytotoxiques essentiels au système immunitaire inné pour provoquer la mort des cellules infectées par lyse ou apoptose. Bien que les fonctions exactes des cellules uNK ne soient pas encore entièrement comprises, plusieurs sources de preuves suggèrent qu’elles sont impliquées dans le remodelage de l’angiogenèse, l’invasion du trophoblaste et le développement fœtal6. L’association entre le pourcentage de cellules uNK par rapport aux cellules stromales et RIF a suscité beaucoup d’intérêt au cours des 20 dernières années. Une méta-analyse récente, qui comprenait 8 études portant sur 604 femmes, a démontré que la densité des cellules CD56+uNK pendant la phase lutéale moyenne est significativement augmentée chez les femmes atteintes de RIF par rapport aux témoins fertiles7. Cependant, il est important de noter que les caractéristiques des cellules uNK au cours de la phase lutéale moyenne diffèrent considérablement de celles des cellules NK déciduales (dNK). Bien que les cellules uNK puissent se différencier en divers sous-ensembles de cellules dNK après la grossesse, la mesure des cellules uNK seule ne représente pas avec précision les cellules dNK8. Les cellules uNK subissent une différenciation dynamique et jouent différents rôles dans le cycle menstruel et les processus de décidualisation, ce qui les rend plus complexes que ce qui peut être identifié par CD56 seul. Plusieurs marqueurs sont nécessaires pour obtenir une compréhension complète du comportement des cellules uNK pendant la préparation de l’endomètre. Notre étude récente a utilisé le séquençage de l’ARN unicellulaire pour identifier la diversité des cellules uNK tout au long des cycles menstruels. Les résultats, validés par cytométrie en flux, ont montré la présence de quatre sous-types distincts de cellules uNK, chacun présentant des changements dynamiques au cours du cycle menstruel9. L’analyse de l’enrichissement génétique et l’enrichissement fonctionnel de l’ontologie génétique indiquent que ces sous-ensembles uNK remplissent des fonctions différentes à différents stades de la menstruation. Néanmoins, la cytométrie en flux n’est pas universellement accessible dans les laboratoires cliniques, et le traitement immédiat du tissu endométrial frais pour la digestion enzymatique rend impossible la répétition des étapes expérimentales en cas d’erreur.

L’objectif de cette étude était donc d’étudier la mesure de ces quatre sous-populations de cellules NK à l’aide d’un test de coloration multiplexe, qui fournit une approche diagnostique plus pratique. Dans la coloration multiple, différents anticorps spécifiques contre chaque cible sont liés à différents marqueurs fluorophores qui émettent différentes longueurs d’onde de lumière lorsqu’ils sont excités par une longueur d’onde spécifique de lumière. Par rapport à la méthode traditionnelle de coloration IHC, cette méthode peut comparer quantitativement l’abondance relative et la distribution de plusieurs cibles dans un échantillon et fournir des informations sur l’interaction et la co-localisation de différentes cibles, ce qui nous permet d’identifier différents sous-types de cellules uNK. Cette approche permettra non seulement d’approfondir notre compréhension de la relation entre les cellules uNK et le RIF, mais aussi d’approfondir l’étude d’autres sous-populations de cellules immunitaires dans les maladies liées à l’endomètre.

Protocol

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche clinique du Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster (CREC ref no. : 2022.581). Les femmes atteintes de RIF ont été recrutées au Centre de technologie de procréation assistée de l’hôpital Prince of Wales de l’Université chinoise de Hong Kong. Le RIF a été défini comme l’échec d’une grossesse clinique après le transfert d’au moins 4 embryons de bonne qualité en un min…

Representative Results

Afin de maintenir une cohérence dans le moment du prélèvement d’échantillons d’endomètre pour les femmes subissant le cycle naturel, un test d’urine a été effectué pour détecter avec précision leur poussée d’hormone lutéinisante (LH), avec des biopsies de l’endomètre effectuées 7 jours après la poussée de LH. Pour les femmes subissant des cycles de THS, les échantillons ont été programmés précisément 5 jours après le début de la supplémentation en proge…

Discussion

L’implantation embryonnaire implique une interaction complexe entre l’embryon et l’endomètre. Le statut immunologique de l’homéostasie de l’endomètre joue un rôle central dans la détermination de la réceptivité de l’endomètre. Au cours de l’OIO, la population leucocytaire prédominante dans l’endomètre est constituée de cellules NK. Environ 90 % des cellules uNK présentent une expression élevée de CD56, mais ne contiennent pas de CD16. Cependant, un sous-ense…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La présente étude a été financée par le Fonds pour la santé et la recherche médicale (10210956).

Materials

CD49a Novus Biologicals NBP2-76478 Primary antibodies
CD56 Leica NCL-L-CD56-504 Primary antibodies
CD16 abcam ab183354 Primary antibodies
CXCR4 R&D MAB172 Primary antibodies
Amplification diluent Akoya Biosciences FP1498 series Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents Akoya Biosciences ARD1001EA Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x) Akoya Biosciences A6001/A9001 Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software Akoya Biosciences inForm Tissue Finder Software 2.2.6 Data analysis software
Mantra Workstations Akoya Biosciences CLS140089 Spectral imaging
microwave Akoya Biosciences inverter Microwave stripping
TSA 520 Akoya Biosciences FP1487001K Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620 Akoya Biosciences FP1495001K Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650 Akoya Biosciences FP1496001K Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570 Akoya Biosciences FP1488001K Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides Fisher Technologies 120-550-15 Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum Perkin Elmer ARH1001EA Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium ThemoFisher Science 495802 Installation
Spectral DAPI Akoya Biosciences FP1490A Nucleic acid staining

References

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Citer Cet Article
Chen, L., Chan, L. K. Y., Wong, S. C. Y., Li, J. J. X., Chung, J. P. W., Wang, C. C., Li, M., Zhang, T. Measurement of Four Uterine NK Cell Subtypes Using Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining in Women with Repeated Implantation Failure. J. Vis. Exp. (212), e67284, doi:10.3791/67284 (2024).

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