Ce protocole décrit la conception, la création et l’application des phosphatases régulées par la rapamycine. Cette méthode offre une spécificité élevée et un contrôle temporel étroit de l’activation de la phosphatase dans les cellules vivantes.
Les tyrosine phosphatases sont une famille importante d’enzymes qui régulent les fonctions physiologiques critiques. Ils sont souvent dérégulés dans les maladies humaines, ce qui en fait des cibles clés des études biologiques. Les outils qui permettent de réguler l’activité de la phosphatase jouent un rôle déterminant dans la dissection de leur fonction. Les approches traditionnelles, telles que la surexpression de mutants négatifs constitutivement actifs ou dominants, ou la régulation négative à l’aide de siRNA, manquent de contrôle temporel. Les inhibiteurs de la phosphatase ont souvent une faible spécificité et ils ne permettent aux chercheurs que de déterminer quels processus sont affectés par l’inhibition de la phosphatase.
Nous avons développé une approche chimiogénétique, le système RapRapR-regulated (RapR), qui permet la régulation allostérique d’un domaine catalytique de la phosphatase qui permet un contrôle temporel serré de l’activation de la phosphatase. Le système RapR est constitué d’un domaine iFKBP inséré dans un site allostérique de la phosphatase. La dynamique structurelle intrinsèque du domaine RapR perturbe le domaine catalytique, conduisant à l’inactivation de l’enzyme. L’ajout de rapamycine médie la formation d’un complexe entre l’iFKBP et une protéine FRB co-exprimée, qui stabilise l’iFKBP et restaure l’activité du domaine catalytique de la phosphatase.
Ce système offre une spécificité élevée et un contrôle temporel étroit de l’activation de la phosphatase dans les cellules vivantes. Les capacités uniques de ce système permettent l’identification d’événements transitoires et l’interrogation de voies de signalisation individuelles en aval d’une phosphatase. Ce protocole décrit les lignes directrices pour le développement d’une RapR-phosphatase, sa caractérisation biochimique et l’analyse de ses effets sur la signalisation en aval et la régulation de la morphodynamique cellulaire. Il fournit également une description détaillée d’une stratégie d’ingénierie des protéines, des tests in vitro analysant l’activité de la phosphatase et des expériences d’imagerie de cellules vivantes identifiant les changements dans la morphologie cellulaire.
Les protéines tyrosine phosphatases sont une famille critique de protéines impliquées dans une pléthore d’événements de signalisation cellulaire. Il a été démontré qu’ils jouent un rôle clé dans la régulation de la prolifération, de la migration et de l’apoptosecellulaires 1,2,3. Par conséquent, la dérégulation des protéines tyrosine phosphatases conduit à une variété de maladies et de troubles débilitants 4,5,6,7. L’étude de la fonction physiologique des tyrosine phosphatases et de leur rôle dans le développement de ces pathologies a toujours été entravée par un manque d’outils nécessaires pour sonder les subtilités de la signalisation de la phosphatase8.
Traditionnellement, les phosphatases sont étudiées à l’aide de méthodes qui n’ont pas la spécificité souhaitée et/ou qui n’assurent pas de contrôle temporel de leur activité. Ces limites critiques des outils disponibles rendent difficile la dissection des rôles spécifiques des phosphatases dans les voies de signalisation. La surexpression de mutants négatifs constitutivement actifs et dominants ou la régulation négative de l’expression de la phosphatase fournissent une spécificité mais manquent de contrôle temporel et peuvent souvent déclencher des mécanismes compensatoires qui masqueront la véritable fonction de l’enzyme.
Les inhibiteurs pharmacologiques permettent la régulation temporelle des phosphatases. Cependant, de nombreux inhibiteurs de la phosphatase sont notoirement non spécifiques en raison de la composition bien conservée du site actif dans les tyrosine phosphatases9. De plus, en raison de contraintes de conception, les inhibiteurs ciblant le site catalytique présentent une faible perméabilité de la membrane cellulaire10. Une autre limitation des inhibiteurs est qu’ils ne permettent d’examiner que les effets de l’inactivation de la phosphatase11. Il est donc nécessaire de disposer d’outils permettant une activation spécifique et régulable dans le temps des phosphatases. Ces outils permettront aux chercheurs d’identifier les effets directs de l’activation de la phosphatase, en les séparant de multiples cascades de signalisation parallèles souvent activées par des stimuli biologiques. Il est important de noter qu’un contrôle temporel étroit de l’activité permet d’identifier les événements transitoires induits par une phosphatase et de séparer les effets de l’activité aiguë et prolongée de la phosphatase. La combinaison de la régulation temporelle et de l’analyse mutationnelle permettra une dissection détaillée des rôles spécifiques des domaines individuels de la phosphatase et l’interrogation de sa signalisation en aval12.
Pour remédier au manque de capacités souhaitées dans les outils existants, le groupe Karginov a développé le système Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. Le système RapR utilise un domaine de commutation modifié, iFKBP, qui permet la régulation allostérique de la protéine d’intérêt (POI). L’insertion du domaine iFKBP à une position allostériquement couplée au site catalytique du POI le rend sensible à la régulation par la rapamycine. En l’absence de rapamycine, l’iFKBP perturbe le site catalytique en raison de la dynamique structurelle intrinsèquement élevée de l’iFKBP et inactive ainsi le POI. L’ajout de rapamycine induit l’interaction de l’iFKBP avec la protéine co-exprimée FRB (Figure 1). Cela provoque une stabilisation du domaine de commutation, ce qui restaure par conséquent la structure et la fonction du domaine catalytique du POI. En tant que tel, l’outil permet une activation spécifique et régulable dans le temps du POI.
Figure 1 : Schéma du système régulé par la rapamycine RapR-Shp2. RapR permet l’activation allostérique de la protéine d’intérêt avec l’ajout de rapamycine. Cette figure a été modifiée à partir de Fauser et al.12. Abréviations : iFKBP = FKBP12 insérable ; FRB = domaine de liaison FKBP-rapamycine ; R = rapamycine ; Shp2 = protéine tyrosine phosphatase contenant le domaine Src homology-2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’outil RapR peut être appliqué à différentes familles de protéines. Il peut être utilisé pour réguler les protéines kinases ainsi que les phosphatases12,14. Ce protocole se concentrera sur l’application de l’outil RapR pour contrôler la phosphatase Shp2. Shp2 est une protéine tyrosine phosphatase exprimée de manière ubiquitaire qui est impliquée dans des processus de signalisation tels que la prolifération, la migration, l’immunomodulation et la différenciation 1,16,17,18. La dérégulation de Shp2 a été associée à un certain nombre de cancers solides, à la leucémie myéloïde et à des troubles du développement 5,7. Cependant, Shp2 a été victime des mêmes défauts d’outils que ceux décrits ci-dessus. Pour lutter contre ces limitations, RapR-Shp2, une construction Shp2 spécifiquement et temporellement régulable, a été développée et caractérisée12.
Avant le développement de RapR-Shp2, on savait que Shp2 était impliqué dans la migration cellulaire 19,20,21. Cependant, son rôle spécifique dans la signalisation impliquée dans ce processus était inconnu. On ne savait pas non plus à quelle échelle de temps Shp2 régule la migration des cellules et quels changements morphodynamiques spécifiques elle induit à différents moments de son activation. De plus, il n’était pas clair si l’activation aiguë et prolongée de Shp2 provoquerait des effets différents. En utilisant RapR-Shp2, il a été constaté que l’activation aiguë de Shp2 induit une propagation cellulaire transitoire, une augmentation des protubérances, une polarisation cellulaire et une migration. Des voies spécifiques en aval de Shp2 qui régulent des changements morphodynamiques distincts ont également été identifiées12. Ce protocole fournit des détails pour la conception et la caractérisation de RapR-Shp2, qui peuvent être utilisés pour guider le développement et l’application d’autres phosphatases RapR.
Ce protocole fournit des étapes détaillées pour le développement, la caractérisation et l’application de phosphatases contrôlées par chimiogénétique. L’outil RapR-Shp2 repose sur un interrupteur régulé par la rapamycine inséré dans le domaine catalytique Shp2. La force de cet outil est la spécificité et le contrôle temporel serré de l’activité de la phosphatase. L’outil est applicable à d’autres phosphatases et, en combinaison avec la technologie RapR-TAP dé…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient la Dre Jordan Fauser pour sa contribution au développement de RapR-Shp2 et des protocoles associés. Le travail a été soutenu par un prix 5R35GM145318 du NIGMS, un prix R33CA258012 du NCI et un prix P01HL151327 du NHLBI.
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0715 | |
1.5 mL Tubes | USA Scientific | cc7682-3394 | |
2x Laemmli Buffer | For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8 | ||
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 4561096 | |
5x Phusion Plus Buffer | Thermo Scientific | F538L | |
A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
Agarsose | GoldBiotech | A-201 | |
Attofluor Cell Chamber | invitrogen | A7816 | |
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-products | 100-106 | Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered |
Brig 35,30 w/v % | Acros | 329581000 | |
BSA | GoldBiotech | A-420 | |
CellGeo | N/A | N/A | Published in 10.1083/jcb.201306067 |
CellMask Deep Red plasma membrane dye | invitrogen | c10046 | |
Colony Screen MasterMix | Genesee | 42-138 | |
DH5a competent cells | NEB | C2987H | |
DMEM | Corning | 15-013-CV | |
DMSO | Thermo Scientific | F-515 | |
DNA Ladder | GoldBio | D010-500 | |
dNTPs | NEB | N04475 | |
DpnI Enzyme | NEB | R01765 | |
DTT | GoldBio | DTT10 | DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents |
EGTA | Acros | 409910250 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | |
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | transfection reagent |
Gel extraction Kit | Thermo Scientific | K0692 | GeneJET Gel Extraction Kit |
Gel Green Nucleic Acid Stain | GoldBio | G-740-500 | |
Gel Loading Dye Purple 6x | NEB | B7024A | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | GlutaMAX-l (100x) 100 mL |
HEK 293T Cells | ATCC | CRL-11268 | |
HeLa Cells | ATCC | CRM-CCL-2 | |
HEPES | Fischer | BP310-500 | |
ImageJ Processing Software | N/A | N/A | |
Igepal CA-630 (NP40) | Sigma | I3021 | |
Imidazole Buffer | 25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT | ||
KCl | Sigma | P-4504 | |
L-15 1x | Corning | 10-045-CV | |
LB Agar | Fisher | BP1425-2 | |
Lysis Buffer | 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40 | ||
MATLAB | MathWorks | N/A | R 2022b update was used to run CellGeo functions |
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software | N/A | N/A | |
MgCl2 | Fisher Chemical | M33-500 | |
Mineral Oil | Sigma | M5310 | |
MiniPrep Kit | Gene Choice | 96-308 | |
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well | Bio-Rad | 4561085 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CV | |
Multiband Polychroic Mirror | Chroma Technology | 89903BS | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-3 | |
Olympus UPlanSAPO 40x objective | Olympus | N/A | |
PBS w/o Ca and Mg | Corning | 21-031-CV | |
PCR Tubes | labForce | 1149Z65 | 0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps |
Phusion Plus DNA Polymerase | Thermo Scientific | F630S | |
Primers | IDT | ||
Protein-G Sepharose | Millipore | 16-266 | |
PVDF Membranes | BioRad | 1620219 | Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches |
Rapamycin | Fisher | AAJ62473MF | |
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium | Corning | 25-053-CI | |
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x | Fischer | BP1332-1 | for electrophoresis |
Wash Buffer | 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40 | ||
β-Mercaptoethanol | Fisher Chemical | O3446I-100 | |
Antibodies | |||
Anti-EGFR Antibody | Cell Signaling | 2232 | |
Anti-Erk 1/2 Antibody | Cell Signaling | 9102 | |
Anti-Flag Antibody | Millipore-Sigma | F3165 | |
Anti-GAPDH Antibody | invitrogen | AM4300 | |
Anti-GFP Antibody | Clontech | 632380 | |
Anti-mCherry Antibody | invitrogen | M11217 | |
Anti-paxillin Antibody | Thermo Fischer | BDB612405 | |
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody | Cell Signaling | 2235 | |
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody | Cell Signaling | 9101 | |
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody | Millipore-Sigma | 05-1143 | |
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody | Cell Signaling | 14008 | |
Anti-PLCγ Antibody | Cell Signaling | 5690 |