Summary

Développement et application de tyrosine phosphatases régulées par la rapamycine

Published: September 06, 2024
doi:

Summary

Ce protocole décrit la conception, la création et l’application des phosphatases régulées par la rapamycine. Cette méthode offre une spécificité élevée et un contrôle temporel étroit de l’activation de la phosphatase dans les cellules vivantes.

Abstract

Les tyrosine phosphatases sont une famille importante d’enzymes qui régulent les fonctions physiologiques critiques. Ils sont souvent dérégulés dans les maladies humaines, ce qui en fait des cibles clés des études biologiques. Les outils qui permettent de réguler l’activité de la phosphatase jouent un rôle déterminant dans la dissection de leur fonction. Les approches traditionnelles, telles que la surexpression de mutants négatifs constitutivement actifs ou dominants, ou la régulation négative à l’aide de siRNA, manquent de contrôle temporel. Les inhibiteurs de la phosphatase ont souvent une faible spécificité et ils ne permettent aux chercheurs que de déterminer quels processus sont affectés par l’inhibition de la phosphatase.

Nous avons développé une approche chimiogénétique, le système RapRapR-regulated (RapR), qui permet la régulation allostérique d’un domaine catalytique de la phosphatase qui permet un contrôle temporel serré de l’activation de la phosphatase. Le système RapR est constitué d’un domaine iFKBP inséré dans un site allostérique de la phosphatase. La dynamique structurelle intrinsèque du domaine RapR perturbe le domaine catalytique, conduisant à l’inactivation de l’enzyme. L’ajout de rapamycine médie la formation d’un complexe entre l’iFKBP et une protéine FRB co-exprimée, qui stabilise l’iFKBP et restaure l’activité du domaine catalytique de la phosphatase.

Ce système offre une spécificité élevée et un contrôle temporel étroit de l’activation de la phosphatase dans les cellules vivantes. Les capacités uniques de ce système permettent l’identification d’événements transitoires et l’interrogation de voies de signalisation individuelles en aval d’une phosphatase. Ce protocole décrit les lignes directrices pour le développement d’une RapR-phosphatase, sa caractérisation biochimique et l’analyse de ses effets sur la signalisation en aval et la régulation de la morphodynamique cellulaire. Il fournit également une description détaillée d’une stratégie d’ingénierie des protéines, des tests in vitro analysant l’activité de la phosphatase et des expériences d’imagerie de cellules vivantes identifiant les changements dans la morphologie cellulaire.

Introduction

Les protéines tyrosine phosphatases sont une famille critique de protéines impliquées dans une pléthore d’événements de signalisation cellulaire. Il a été démontré qu’ils jouent un rôle clé dans la régulation de la prolifération, de la migration et de l’apoptosecellulaires 1,2,3. Par conséquent, la dérégulation des protéines tyrosine phosphatases conduit à une variété de maladies et de troubles débilitants 4,5,6,7. L’étude de la fonction physiologique des tyrosine phosphatases et de leur rôle dans le développement de ces pathologies a toujours été entravée par un manque d’outils nécessaires pour sonder les subtilités de la signalisation de la phosphatase8.

Traditionnellement, les phosphatases sont étudiées à l’aide de méthodes qui n’ont pas la spécificité souhaitée et/ou qui n’assurent pas de contrôle temporel de leur activité. Ces limites critiques des outils disponibles rendent difficile la dissection des rôles spécifiques des phosphatases dans les voies de signalisation. La surexpression de mutants négatifs constitutivement actifs et dominants ou la régulation négative de l’expression de la phosphatase fournissent une spécificité mais manquent de contrôle temporel et peuvent souvent déclencher des mécanismes compensatoires qui masqueront la véritable fonction de l’enzyme.

Les inhibiteurs pharmacologiques permettent la régulation temporelle des phosphatases. Cependant, de nombreux inhibiteurs de la phosphatase sont notoirement non spécifiques en raison de la composition bien conservée du site actif dans les tyrosine phosphatases9. De plus, en raison de contraintes de conception, les inhibiteurs ciblant le site catalytique présentent une faible perméabilité de la membrane cellulaire10. Une autre limitation des inhibiteurs est qu’ils ne permettent d’examiner que les effets de l’inactivation de la phosphatase11. Il est donc nécessaire de disposer d’outils permettant une activation spécifique et régulable dans le temps des phosphatases. Ces outils permettront aux chercheurs d’identifier les effets directs de l’activation de la phosphatase, en les séparant de multiples cascades de signalisation parallèles souvent activées par des stimuli biologiques. Il est important de noter qu’un contrôle temporel étroit de l’activité permet d’identifier les événements transitoires induits par une phosphatase et de séparer les effets de l’activité aiguë et prolongée de la phosphatase. La combinaison de la régulation temporelle et de l’analyse mutationnelle permettra une dissection détaillée des rôles spécifiques des domaines individuels de la phosphatase et l’interrogation de sa signalisation en aval12.

Pour remédier au manque de capacités souhaitées dans les outils existants, le groupe Karginov a développé le système Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. Le système RapR utilise un domaine de commutation modifié, iFKBP, qui permet la régulation allostérique de la protéine d’intérêt (POI). L’insertion du domaine iFKBP à une position allostériquement couplée au site catalytique du POI le rend sensible à la régulation par la rapamycine. En l’absence de rapamycine, l’iFKBP perturbe le site catalytique en raison de la dynamique structurelle intrinsèquement élevée de l’iFKBP et inactive ainsi le POI. L’ajout de rapamycine induit l’interaction de l’iFKBP avec la protéine co-exprimée FRB (Figure 1). Cela provoque une stabilisation du domaine de commutation, ce qui restaure par conséquent la structure et la fonction du domaine catalytique du POI. En tant que tel, l’outil permet une activation spécifique et régulable dans le temps du POI.

Figure 1
Figure 1 : Schéma du système régulé par la rapamycine RapR-Shp2. RapR permet l’activation allostérique de la protéine d’intérêt avec l’ajout de rapamycine. Cette figure a été modifiée à partir de Fauser et al.12. Abréviations : iFKBP = FKBP12 insérable ; FRB = domaine de liaison FKBP-rapamycine ; R = rapamycine ; Shp2 = protéine tyrosine phosphatase contenant le domaine Src homology-2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’outil RapR peut être appliqué à différentes familles de protéines. Il peut être utilisé pour réguler les protéines kinases ainsi que les phosphatases12,14. Ce protocole se concentrera sur l’application de l’outil RapR pour contrôler la phosphatase Shp2. Shp2 est une protéine tyrosine phosphatase exprimée de manière ubiquitaire qui est impliquée dans des processus de signalisation tels que la prolifération, la migration, l’immunomodulation et la différenciation 1,16,17,18. La dérégulation de Shp2 a été associée à un certain nombre de cancers solides, à la leucémie myéloïde et à des troubles du développement 5,7. Cependant, Shp2 a été victime des mêmes défauts d’outils que ceux décrits ci-dessus. Pour lutter contre ces limitations, RapR-Shp2, une construction Shp2 spécifiquement et temporellement régulable, a été développée et caractérisée12.

Avant le développement de RapR-Shp2, on savait que Shp2 était impliqué dans la migration cellulaire 19,20,21. Cependant, son rôle spécifique dans la signalisation impliquée dans ce processus était inconnu. On ne savait pas non plus à quelle échelle de temps Shp2 régule la migration des cellules et quels changements morphodynamiques spécifiques elle induit à différents moments de son activation. De plus, il n’était pas clair si l’activation aiguë et prolongée de Shp2 provoquerait des effets différents. En utilisant RapR-Shp2, il a été constaté que l’activation aiguë de Shp2 induit une propagation cellulaire transitoire, une augmentation des protubérances, une polarisation cellulaire et une migration. Des voies spécifiques en aval de Shp2 qui régulent des changements morphodynamiques distincts ont également été identifiées12. Ce protocole fournit des détails pour la conception et la caractérisation de RapR-Shp2, qui peuvent être utilisés pour guider le développement et l’application d’autres phosphatases RapR.

Protocol

1. Conception des RapR-phosphatases PlanificationREMARQUE : En utilisant RapR-Shp2 comme exemple, ce protocole détaille les étapes importantes pour la création d’une tyrosine phosphatase régulée par la rapamycine. Le protocole décrit est optimisé pour Shp2 et des modifications supplémentaires peuvent être nécessaires pour s’adapter aux propriétés spécifiques des phosphatases individuelles.Pour s’assurer que l’activité catalytiq…

Representative Results

La figure 4 montre les résultats que l’on peut attendre du test d’activité de la phosphatase à base de paxilline. Dans cette expérience, l’activité négative de la phosphatase Shp2, constitutivement active et dominante, a été comparée à celle de la RapR-Shp2 active et inactive en utilisant la phospho-paxilline comme lecture. Les constructions de Shp2 ont été immunoprécipitées et soumises au test d’activité décrit dans le protocole. Les…

Discussion

Ce protocole fournit des étapes détaillées pour le développement, la caractérisation et l’application de phosphatases contrôlées par chimiogénétique. L’outil RapR-Shp2 repose sur un interrupteur régulé par la rapamycine inséré dans le domaine catalytique Shp2. La force de cet outil est la spécificité et le contrôle temporel serré de l’activité de la phosphatase. L’outil est applicable à d’autres phosphatases et, en combinaison avec la technologie RapR-TAP dé…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient la Dre Jordan Fauser pour sa contribution au développement de RapR-Shp2 et des protocoles associés. Le travail a été soutenu par un prix 5R35GM145318 du NIGMS, un prix R33CA258012 du NCI et un prix P01HL151327 du NHLBI.

Materials

#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round Warner Instruments 64-0715
1.5 mL Tubes USA Scientific cc7682-3394
2x Laemmli Buffer For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Biorad 4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
A431 Cells ATCC CRL-1555
Agarsose GoldBiotech A-201
Attofluor Cell Chamber invitrogen A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-products 100-106 Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v % Acros 329581000
BSA GoldBiotech A-420
CellGeo N/A N/A Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye invitrogen c10046
Colony Screen MasterMix Genesee 42-138
DH5a competent cells NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
DMSO Thermo Scientific F-515
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEB N04475
DpnI Enzyme NEB R01765
DTT GoldBio DTT10 DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA Acros 409910250
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent Promega E2692 transfection reagent
Gel extraction Kit Thermo Scientific K0692 GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain GoldBio G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x NEB B7024A
Glutamax Gibco 35050-061 GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells ATCC CRL-11268
HeLa Cells ATCC CRM-CCL-2
HEPES Fischer BP310-500
ImageJ Processing Software N/A N/A
Igepal CA-630 (NP40) Sigma I3021
Imidazole Buffer 25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl Sigma P-4504
L-15 1x Corning 10-045-CV
LB Agar Fisher BP1425-2
Lysis Buffer 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB MathWorks N/A R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software N/A N/A
MgCl2 Fisher Chemical M33-500
Mineral Oil Sigma M5310
MiniPrep Kit Gene Choice 96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well Bio-Rad 4561085
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror Chroma Technology 89903BS
NaCl Fisher Chemical S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective Olympus N/A
PBS w/o Ca and Mg Corning 21-031-CV
PCR Tubes labForce 1149Z65 0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase Thermo Scientific F630S
Primers IDT
Protein-G Sepharose Millipore 16-266
PVDF Membranes BioRad 1620219 Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin Fisher AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium Corning 25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Fischer BP1332-1 for electrophoresis
Wash Buffer 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol Fisher Chemical O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody Cell Signaling 2232
Anti-Erk 1/2 Antibody Cell Signaling 9102
Anti-Flag Antibody Millipore-Sigma F3165
Anti-GAPDH Antibody invitrogen AM4300
Anti-GFP Antibody Clontech 632380
Anti-mCherry Antibody invitrogen M11217
Anti-paxillin Antibody Thermo Fischer BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody Cell Signaling 2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody Cell Signaling 9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody Millipore-Sigma 05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody Cell Signaling 14008
Anti-PLCγ Antibody Cell Signaling 5690

References

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Citer Cet Article
Szynal, B. N., Bradford-Olson, H., Karginov, A. V. Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases. J. Vis. Exp. (211), e67142, doi:10.3791/67142 (2024).

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