Purificazione basata sul sistema MultiBac e caratterizzazione biofisica della miosina-7a umana

Le miosine sono proteine motrici molecolari che interagiscono con l’actina per guidare numerosi processi cellulari 1,2,3,4. Gli esseri umani possiedono 12 classi e 39 geni della miosina⁵, che sono coinvolti in un’ampia gamma di funzioni fisiologiche, come la contrazione muscolare⁶ e i processi sensoriali⁷. Ogni molecola di miosina è un complesso multimerico composto da una catena pesante e da catene leggere. La catena pesante è divisa in regioni della testa, del collo e della coda. La testa contiene siti di legame dell’actina e del nucleotide che sono responsabili dell’idrolisi dell’ATP e della generazione di forza sui filamenti di actina². Il collo è formato da diversi motivi IQ a α elicoidali in cui è legato un insieme specifico di catene leggere. Insieme funzionano come un braccio di leva per amplificare i cambiamenti conformazionali del motore in grandi movimenti ^8,9,10. La coda contiene sottodomini specifici di classe e svolge un ruolo regolatorio nella regolazione dell’attività motoria della miosina e nella mediazione delle interazioni con i partner di legame cellulare ^2,11.

La miosina-7a umana, un membro della miosina di classe 7, è essenziale per i processi uditivi e visivi^12,13. I motivi del QI della miosina-7a umana sono associati a una combinazione unica di catene leggere, tra cui la catena leggera regolatoria (RLC), la calmodulina e la proteina 4 simile alla calmodulina (CALML4)14,15,16. Oltre a stabilizzare il braccio di leva, queste catene leggere regolano le proprietà meccaniche della miosina-7a in risposta alla segnalazione del calcio, una caratteristica che sembra essere unica per l’isoforma¹⁴ dei mammiferi.

I difetti nel gene che codifica per la catena pesante della miosina-7a (MYO7A/USH1B) sono responsabili della sindrome di Usher di tipo 1, la forma più grave di perdita combinata della vista e dell’udito nell’uomo¹⁷. Inoltre, il gene della catena leggera CALML4 è tra i geni candidati mappati per contenere l’allele causativo per USH1H, un’altra variante della sindrome di Usher di tipo 1^15,18. Nella retina, la miosina-7a è espressa nell’epitelio pigmentato retinico e nelle cellule fotorecettrici¹³. È stato implicato nella localizzazione dei melanosomi nell’epitelio pigmentato retinico (RPE)¹⁹ e nella fagocitosi dei dischi del segmento esterno dei fotorecettori da parte delle cellule RPE²⁰. Nell’orecchio interno, la miosina-7a si trova principalmente nelle stereociglia, dove svolge un ruolo fondamentale nella creazione di fasci di capelli e nel controllo del processo di trasduzione meccano-elettrica 12,21,22.

Mentre l’importanza della miosina-7a nelle cellule sensoriali è ben consolidata, i suoi meccanismi funzionali a livello molecolare rimangono poco compresi. Questa lacuna nelle conoscenze è in parte dovuta alle sfide nella purificazione della proteina intatta, in particolare dell’isoforma dei mammiferi. Recentemente, sono stati compiuti progressi significativi utilizzando il sistema MultiBac per esprimere in modo ricombinante l’oloenzima¹⁴ completo della miosina-7a umana. Questo progresso ha permesso la caratterizzazione strutturale e biofisica di questa proteina motrice, portando alla scoperta di diverse proprietà uniche della miosina-7a umana che sono specificamente adattate per le funzioni uditive dei mammiferi^14,23.

Il sistema MultiBac è una piattaforma avanzata di baculovirus/cellule di insetti specificamente progettata per l’espressione di complessi multimerici eucariotici^24,25. Una caratteristica chiave di questo sistema è la sua capacità di ospitare più cassette di espressione genica, ciascuna delle quali codifica per una subunità del complesso, all’interno di un singolo baculovirus MultiBac. L’assemblaggio delle cassette di espressione multigenica è facilitato attraverso un cosiddetto modulo di moltiplicazione: un sito di endonucleasi di homing (HE) e un sito BstXI progettato per la corrispondenza che fiancheggia i siti di clonazione multipli (MCS). Questo modulo consente l’assemblaggio iterativo di una singola cassetta di espressione mediante restrizione/legatura, sfruttando il fatto che i siti di restrizione HE e BstXI vengono eliminati al momento della legatura. In questo articolo, la catena pesante della miosina-7a umana, RLC, calmodulina e CALML4 sono clonate nel modulo di moltiplicazione all’interno del vettore pACEBac1 (Figura 1A), che vengono poi assemblate in una cassetta di espressione multigenica attraverso il processo iterativo (Figura 1B). La cassetta multigenica della miosina-7a è integrata nel genoma baculovirale (bacmid) attraverso la trasposizione dell’elemento mini-Tn7 dal vettore pACEBac1 al sito bersaglio mini-attTn7 nel genoma (Figura 1C). Seguendo le procedure per la purificazione del bacmid, la produzione di baculovirus e l’amplificazione (Figura 1D, E), viene preparato il baculovirus ricombinante Myosin-7a MultiBac che può essere utilizzato per la produzione di proteine su larga scala (Figura 1F). Inoltre, le catene leggere della miosina-7a possono essere prodotte separatamente in E. coli e purificate utilizzando un tag His6-SUMO 26,27,28 scissabile. Le catene leggere purificate sono utili per studiare la loro dinamica di legame e la regolazione della miosina-7a.

La proteina miosina-7a purificata può essere sottoposta a studi strutturali, biochimici e biofisici per ottenere informazioni sulla regolazione strutturale-funzionale di questa proteina motrice. Inoltre, le sue interazioni con la rete di actina e altre proteine leganti²⁹ possono essere esaminate utilizzando una varietà di approcci di ricostituzione in vitro. I risultati di queste analisi informeranno le proprietà biofisiche di questa miosina, portando a una comprensione meccanicistica di come la miosina-7a guida i cambiamenti del citoscheletro e, in ultima analisi, modella la morfologia e la funzione uniche delle cellule sensoriali. In questo articolo, descriviamo in dettaglio un flusso di lavoro per il saggio di scorrimento del filamento di actina che è stato specificamente adattato per la miosina-7a dei mammiferi. Il saggio di scorrimento del filamento di actina è un robusto test di motilità in vitro che studia quantitativamente il movimento dei filamenti fluorescenti di actina spinti da un gran numero di motori di miosina immobilizzati su una superficie di vetrino 30,31,32. I vantaggi di questo test includono la semplicità di configurazione, i requisiti minimi di attrezzatura (un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di una fotocamera digitale) e l’elevata riproducibilità. Inoltre, poiché il movimento dei filamenti di actina è guidato da un gruppo di motori di miosina immobilizzati, questo test è particolarmente utile per studiare la motilità di miosine monomeriche come la miosina-7a^14,33. I protocolli includono diverse modifiche, dalle procedure sperimentali all’analisi di imaging, specificamente adattate alle proprietà mobili uniche della miosina-7a dei mammiferi. Con la disponibilità della proteina miosina-7a intatta e il protocollo di caratterizzazione funzionale qui descritto, questo articolo pone le basi per ulteriori indagini sui ruoli molecolari della miosina-7a nei processi sia fisiologici che patologici.