Summary

Génération d’organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Published: December 13, 2024
doi:

Summary

Ce protocole présente une méthode de génération d’organoïdes vasculaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines.

Abstract

Les organoïdes vasculaires dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent la diversité des types cellulaires et l’architecture complexe des réseaux vasculaires humains. Ce modèle tridimensionnel (3D) présente un potentiel substantiel pour la modélisation de pathologies vasculaires et le criblage de médicaments in vitro . Malgré les progrès récents, un défi technique majeur reste à relever pour générer des organoïdes de manière reproductible avec une qualité constante, ce qui est crucial pour les tests et les applications en aval. Ici, un protocole modifié est présenté qui améliore à la fois l’homogénéité et la reproductibilité de la génération d’organoïdes vasculaires. Le protocole modifié intègre l’utilisation de micropuits et du cocktail CEPT (chromane 1, emricasan, polyamines et l’inhibiteur intégré de la réponse au stress, trans-ISRIB) pour améliorer la formation du corps embryoïde et la survie cellulaire. Les organoïdes vasculaires différenciés et matures générés à l’aide de ce protocole sont caractérisés par une microscopie d’immunofluorescence 3D à montage entier pour analyser leur morphologie et leur système vasculaire complexe. Ce protocole permet la production d’organoïdes vasculaires de haute qualité de manière évolutive, ce qui facilite potentiellement leur utilisation dans les applications de modélisation de maladies et de criblage de médicaments.

Introduction

Des modèles microphysiologiques in vitro, y compris des systèmes d’organoïdes et de tissus sur puce, ont émergé au cours de la dernière décennie 1,2,3. Ces systèmes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules humaines répondent aux limites de la culture cellulaire bidimensionnelle conventionnelle (2D) et des modèles animaux, telles que l’absence de nombreux composants dans le microenvironnement physiologique et les différences génétiques entre les espèces, respectivement. Ils fournissent plus d’informations physiologiques et sont plus adaptés à la modélisation des maladies et au criblage de médicaments que les modèles conventionnels. Parmi les modèles microphysiologiques, il a été prouvé que les organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent efficacement les caractéristiques architecturales des tissus humains natifs et ont été développés pour imiter différents organes humains, notamment le cerveau 4,5, les reins6, le foie 7,8 et la rétine9. Ici, nous nous concentrons particulièrement sur la génération d’organoïdes vasculaires à partir d’hiPSC et décrivons un protocole rationalisé qui vise à minimiser les variations entre différents échantillons et lots d’organoïdes, améliorant ainsi la reproductibilité globale.

La vascularisation joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie physiologique dans tous les organes humains. La formation de la vascularisation implique les processus de vasculogenèse et d’angiogenèse, orchestrés par les interactions entre les cellules endothéliales et murales (par exemple, les péricytes et les cellules musculaires lisses vasculaires) et influencés par divers stimuli10. Penninger, Wimmer et leurs collègues ont mis au point la première méthode de génération d’organoïdes vasculaires11,12 qui imite ces deux processus. Avec les organoïdes générés par cette méthode, leur groupe12 et nous13,14 avons démontré le potentiel des organoïdes vasculaires pour modéliser les dysfonctionnements vasculaires dans les maladies. Par exemple, dans nos travaux récents 13,14, des phénotypes distincts ont été observés, tels que la germination des vaisseaux et les variations de la composition cellulaire murale, entre les organoïdes vasculaires imitant la maladie et leurs homologues de type sauvage. Ces exemples mettent en évidence que le modèle d’organoïde vasculaire pourrait servir de plate-forme pour le criblage de médicaments en imitant les dysfonctionnements vasculaires liés à la maladie.

S’appuyant sur les travaux initiaux de génération d’organoïdes vasculaires11,12, un protocole révisé est présenté qui comprend l’utilisation de micropuits pour faciliter la formation homogène de corps embryoïdes (EB), un facteur critique pour minimiser les variations souvent observées au sein d’un même lot de génération d’organoïdes. De plus, le cocktail CEPT, une combinaison de chromane 1, d’emricasan, de polyamines et de l’inhibiteur intégré de la réponse au stress (trans-ISRIB)15, est utilisé pour améliorer la viabilité des hiPSC et des cellules différenciées au cours du processus de formation de l’EB. Cette modification vise principalement à réduire les variations entre les différents échantillons et lots d’organoïdes. Des organoïdes vasculaires uniformes peuvent être produits avec ce protocole d’environ deux semaines, où la vasculogenèse est induite pour aider l’endothélium à s’organiser en réseaux tubulaires primitifs le jour 1, suivie de l’induction de l’angiogenèse le jour 5 pour développer des réseaux vasculaires complexes dans les organoïdes. Du 12e au 15e jour, les organoïdes générés devraient montrer des réseaux vasculaires matures composés à la fois de cellules endothéliales et murales.

Protocol

La figure 1 présente un aperçu des étapes de ce protocole. Des informations détaillées concernant les réactifs et les matériaux utilisés dans ce protocole sont fournies dans la table des matériaux. Il est recommandé de préchauffer tous les fluides à 37 °C avant utilisation, sauf indication contraire. Tout le matériel et les fournitures de culture cellulaire doivent être autoclavés ou stériles, et la manipulation des cellules…

Representative Results

La figure 1A présente le schéma de ce protocole, y compris les composants clés utilisés dans chaque étape. La différenciation a commencé avec la formation de l’EB, suivie de l’induction du mésoderme et de la spécification de la lignée vasculaire (Figure 1B-D). Les agrégats sont devenus plus grands et moins sphériques au fil du temps. Les organoïdes ont commencé à montrer des b…

Discussion

Le protocole décrit comprend deux modifications clés pour la génération homogène et reproductible d’organoïdes vasculaires de haute qualité. La première modification est l’utilisation d’une plaque à micropuits pour permettre un meilleur contrôle de l’uniformité de l’EB. En tant que point de départ de la différenciation vasculaire, la taille des EB est essentielle car elle régule le destin des cellules souches et l’efficacité de la différenciation envers diffé…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à souligner le soutien technique de la ressource partagée en microscopie confocale et spécialisée du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia, financée en partie par le NIH Center Grant (P30CA013696). Ce travail est soutenu par NIH (R21NS133635, Y.-H.L. ; UH3TR002151, K. W. L.). La figure 1A a été créée à l’aide de BioRender.

Materials

2-Mercaptoethanol (1000x) Gibco 21985023
Accutase Sigma-Aldrich A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs 711-546-152 reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)  Jackson Immuno Research Labs 705-606-147 reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x) Gibco 12587010 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4 ProSpec CYT-081 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody  abcam ab28364 dilution ratio: 1:400
Centrifuge Eppendorf 022626001
CHIR99021 Tocris Bioscience 4423/10 make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1 Tocris 7163/10 make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I  Corning 40236
Confocal Microscope Nikon AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates Corning 4441
Countess II FL automated cell counter Thermo Fisher AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco 10565018
DMEM/F-12, powder Gibco 12500062 make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A Cedars Sinai
Emricasan Medchemexpress LLC HY1039610MG make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody Cell Singali Technology 97249 dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum – Premium Atlanta Biologicals S11150 thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2 ProSpec CYT557 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish World Precision Instruments FD35-100
Forskolin Tocris Bioscience 1099 reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15710064
GlutaMAX supplement (100x) Gibco 35050061
Heparin, 100 kU MilliporeSigma 375095100KU reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Incubator Thermo Scientific 13998123
Knockout Serum Replacement Gibco 10828028 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix Corning 356230 thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x) Gibco 11140050
Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV
mTeSR plus kit STEMCELL Technologies 1001130 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x) Gibco 17502048 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M) Cytiva HyClone SH31088.01
NeuroBasal medium Gibco 21103049
NIS-Elements, ver 5.42 Nikon
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research Labs 17000121 reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713S dilute with PBS
PBST, 20x Thermofisher 28352
PDGFRβ antibody R&D AF385 dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x) Sigma-Aldrich P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49 SUNJIN LAB RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080094
Sodium deoxycholate monohydrate Thermofisher J6228822 dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x Thermofisher 28360
trans-ISRIB Tocris Bioscience 5284/10 make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher 15250061
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML
VEGF-A ProSpec CYT-116 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C

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Citer Cet Article
Xu, C., He, S., Zhu, Y., Crasto, G., Chen, C., Clay, M. L., Lao, Y., Leong, K. W. Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (214), e67125, doi:10.3791/67125 (2024).

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