Ce protocole présente une méthode de génération d’organoïdes vasculaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines.
Les organoïdes vasculaires dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent la diversité des types cellulaires et l’architecture complexe des réseaux vasculaires humains. Ce modèle tridimensionnel (3D) présente un potentiel substantiel pour la modélisation de pathologies vasculaires et le criblage de médicaments in vitro . Malgré les progrès récents, un défi technique majeur reste à relever pour générer des organoïdes de manière reproductible avec une qualité constante, ce qui est crucial pour les tests et les applications en aval. Ici, un protocole modifié est présenté qui améliore à la fois l’homogénéité et la reproductibilité de la génération d’organoïdes vasculaires. Le protocole modifié intègre l’utilisation de micropuits et du cocktail CEPT (chromane 1, emricasan, polyamines et l’inhibiteur intégré de la réponse au stress, trans-ISRIB) pour améliorer la formation du corps embryoïde et la survie cellulaire. Les organoïdes vasculaires différenciés et matures générés à l’aide de ce protocole sont caractérisés par une microscopie d’immunofluorescence 3D à montage entier pour analyser leur morphologie et leur système vasculaire complexe. Ce protocole permet la production d’organoïdes vasculaires de haute qualité de manière évolutive, ce qui facilite potentiellement leur utilisation dans les applications de modélisation de maladies et de criblage de médicaments.
Des modèles microphysiologiques in vitro, y compris des systèmes d’organoïdes et de tissus sur puce, ont émergé au cours de la dernière décennie 1,2,3. Ces systèmes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules humaines répondent aux limites de la culture cellulaire bidimensionnelle conventionnelle (2D) et des modèles animaux, telles que l’absence de nombreux composants dans le microenvironnement physiologique et les différences génétiques entre les espèces, respectivement. Ils fournissent plus d’informations physiologiques et sont plus adaptés à la modélisation des maladies et au criblage de médicaments que les modèles conventionnels. Parmi les modèles microphysiologiques, il a été prouvé que les organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent efficacement les caractéristiques architecturales des tissus humains natifs et ont été développés pour imiter différents organes humains, notamment le cerveau 4,5, les reins6, le foie 7,8 et la rétine9. Ici, nous nous concentrons particulièrement sur la génération d’organoïdes vasculaires à partir d’hiPSC et décrivons un protocole rationalisé qui vise à minimiser les variations entre différents échantillons et lots d’organoïdes, améliorant ainsi la reproductibilité globale.
La vascularisation joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie physiologique dans tous les organes humains. La formation de la vascularisation implique les processus de vasculogenèse et d’angiogenèse, orchestrés par les interactions entre les cellules endothéliales et murales (par exemple, les péricytes et les cellules musculaires lisses vasculaires) et influencés par divers stimuli10. Penninger, Wimmer et leurs collègues ont mis au point la première méthode de génération d’organoïdes vasculaires11,12 qui imite ces deux processus. Avec les organoïdes générés par cette méthode, leur groupe12 et nous13,14 avons démontré le potentiel des organoïdes vasculaires pour modéliser les dysfonctionnements vasculaires dans les maladies. Par exemple, dans nos travaux récents 13,14, des phénotypes distincts ont été observés, tels que la germination des vaisseaux et les variations de la composition cellulaire murale, entre les organoïdes vasculaires imitant la maladie et leurs homologues de type sauvage. Ces exemples mettent en évidence que le modèle d’organoïde vasculaire pourrait servir de plate-forme pour le criblage de médicaments en imitant les dysfonctionnements vasculaires liés à la maladie.
S’appuyant sur les travaux initiaux de génération d’organoïdes vasculaires11,12, un protocole révisé est présenté qui comprend l’utilisation de micropuits pour faciliter la formation homogène de corps embryoïdes (EB), un facteur critique pour minimiser les variations souvent observées au sein d’un même lot de génération d’organoïdes. De plus, le cocktail CEPT, une combinaison de chromane 1, d’emricasan, de polyamines et de l’inhibiteur intégré de la réponse au stress (trans-ISRIB)15, est utilisé pour améliorer la viabilité des hiPSC et des cellules différenciées au cours du processus de formation de l’EB. Cette modification vise principalement à réduire les variations entre les différents échantillons et lots d’organoïdes. Des organoïdes vasculaires uniformes peuvent être produits avec ce protocole d’environ deux semaines, où la vasculogenèse est induite pour aider l’endothélium à s’organiser en réseaux tubulaires primitifs le jour 1, suivie de l’induction de l’angiogenèse le jour 5 pour développer des réseaux vasculaires complexes dans les organoïdes. Du 12e au 15e jour, les organoïdes générés devraient montrer des réseaux vasculaires matures composés à la fois de cellules endothéliales et murales.
Le protocole décrit comprend deux modifications clés pour la génération homogène et reproductible d’organoïdes vasculaires de haute qualité. La première modification est l’utilisation d’une plaque à micropuits pour permettre un meilleur contrôle de l’uniformité de l’EB. En tant que point de départ de la différenciation vasculaire, la taille des EB est essentielle car elle régule le destin des cellules souches et l’efficacité de la différenciation envers diffé…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à souligner le soutien technique de la ressource partagée en microscopie confocale et spécialisée du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia, financée en partie par le NIH Center Grant (P30CA013696). Ce travail est soutenu par NIH (R21NS133635, Y.-H.L. ; UH3TR002151, K. W. L.). La figure 1A a été créée à l’aide de BioRender.
2-Mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 711-546-152 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 705-606-147 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
B27 supplement minus vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle |
BMP4 | ProSpec | CYT-081 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
CD31 antibody | abcam | ab28364 | dilution ratio: 1:400 |
Centrifuge | Eppendorf | 022626001 | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423/10 | make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Chroman 1 | Tocris | 7163/10 | make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Collagen I | Corning | 40236 | |
Confocal Microscope | Nikon | AXRMP/Ti2 | |
Corning Elplasia Plates | Corning | 4441 | |
Countess II FL automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAF1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | |
DMEM/F-12, powder | Gibco | 12500062 | make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C. |
Edi042A | Cedars Sinai | ||
Emricasan | Medchemexpress LLC | HY1039610MG | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
ERG antibody | Cell Singali Technology | 97249 | dilution ratio: 1:400 |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | thaw at 4 °C and aliquot, store at -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month |
FGF2 | ProSpec | CYT557 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
Fluorodish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C |
Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15710064 | |
GlutaMAX supplement (100x) | Gibco | 35050061 | |
Heparin, 100 kU | MilliporeSigma | 375095100KU | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
Incubator | Thermo Scientific | 13998123 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828028 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x) | Gibco | 11140050 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | |
mTeSR plus kit | STEMCELL Technologies | 1001130 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
N2 supplement (100x) | Gibco | 17502048 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
NaOH solution (1 M) | Cytiva HyClone | SH31088.01 | |
NeuroBasal medium | Gibco | 21103049 | |
NIS-Elements, ver 5.42 | Nikon | ||
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research Labs | 17000121 | reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks |
paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713S | dilute with PBS |
PBST, 20x | Thermofisher | 28352 | |
PDGFRβ antibody | R&D | AF385 | dilution ratio: 1:400 |
polyamine supplement (1000x) | Sigma-Aldrich | P8483 | |
Rapiclear clearing reagent, 1.49 | SUNJIN LAB | RC149001 | |
Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080094 | |
Sodium deoxycholate monohydrate | Thermofisher | J6228822 | dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution |
TBST, 20x | Thermofisher | 28360 | |
trans-ISRIB | Tocris Bioscience | 5284/10 | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year. |
Tritin X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
VEGF-A | ProSpec | CYT-116 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C |