Les inserts de culture tissulaire avec membranes en plastique sont la référence dans les laboratoires de culture cellulaire en tant que supports perméables pour établir des couches cellulaires et des modèles de tissus barrières. Ici, nous présentons une méthode simple pour remplacer la membrane plastique par une membrane plus pertinente sur le plan biologique, fabriquée à partir d’une protéine de soie d’araignée fonctionnalisée recombinante.
La réplication des barrières tissulaires est essentielle pour générer des modèles in vitro pertinents pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Aujourd’hui, cela se fait couramment à l’aide d’inserts de culture tissulaire avec une membrane en plastique, ce qui génère un côté apical et un côté basal. En plus de fournir un soutien aux cellules, ces membranes sont loin d’imiter leur homologue natif, la membrane basale, qui est une matrice nanofibrillaire à base de protéines. Dans ce travail, nous montrons un moyen simple d’améliorer considérablement la pertinence biologique des inserts de culture tissulaire en remplaçant la membrane plastique par une membrane fabriquée à partir d’une protéine de soie d’araignée fonctionnalisée recombinante pure. La membrane de soie se forme par auto-assemblage et adhère spontanément à un insert de culture tissulaire sans membrane, où elle peut fournir un support aux cellules. Des inserts de culture tissulaire conçus sur mesure peuvent être imprimés à l’aide d’une imprimante 3D standard, en suivant les instructions fournies dans le protocole, ou des inserts commerciaux peuvent être achetés et utilisés à la place. Ce protocole montre comment le système de culture avec des membranes de soie dans des inserts est mis en place et, par la suite, comment les mêmes techniques de culture cellulaire que celles utilisées avec des inserts traditionnels disponibles dans le commerce peuvent être mises en œuvre.
Les modèles in vitro capables de reproduire les barrières tissulaires ont fait l’objet d’une attention croissante en raison de leur applicabilité à l’essai de nouvelles thérapies et à la compréhension des mécanismes fondamentaux de la maladie 1,2. Pour recréer avec précision le microenvironnement natif, il est essentiel de récapituler la fonction de la membrane basale (BM), un complexe de matrice extracellulaire (ECM) hautement spécialisé. Le BM existe dans presque tous les tissus du corps humain, où il fournit un soutien aux cellules endothéliales et épithéliales et les sépare des tissus sous-jacents 2,3. En plus de fournir un soutien physique, le BM régule et maintient également les signaux biochimiques entre les cellules et les tissus environnants. Ces fonctions vitales rendent nécessaire la conception d’échafaudages qui ressemblent à la structure, ainsi qu’aux caractéristiques mécaniques et fonctionnelles du BM3 natif.
L’une des façons les plus courantes d’imiter la BM in vitro aujourd’hui est d’utiliser des inserts de culture tissulaire disponibles dans le commerce (TC-inserts). Il s’agit essentiellement de cylindres en plastique avec une membrane perméable qui divise la chambre en côtés apical et basolatéral 4,5. Bien que faciles à utiliser, les membranes des inserts commerciaux sont généralement rigides, gravées sur chenilles et fabriquées à partir de polymères tels que le poly(carbonate) (PC) et le poly(téréphtalate d’éthylène) (PET)3,4,6. Ils sont flexibles en termes de diamètre, de densité de pores et de taille et peuvent être recouverts pour améliorer l’adhérence cellulaire, mais il leur manque toutes les autres caractéristiques pertinentes du BM, telles que l’épaisseur comparable6, la porosité interconnectée, l’architecture fibreuse et le module d’élasticité3.
La standardisation des inserts TC et leur facilité d’utilisation ont inspiré plusieurs groupes, dont le nôtre, à remplacer la membrane plastique par une contrepartie plus proche de celle in vivo (vue d’ensemble dans le tableau 1). Les matériaux utilisés vont des polymères tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS)7, le poly(lactide-co-caprolactone) (PLCL)8 et la polycaprolactone (PCL)4,9,10 aux matériaux à base de protéines tels que la gélatine 2,11,12, le collagène 5,13 et la soie d’araignée recombinante 14,15,16,17. Les membranes de ces matériaux ont été fixées de diverses manières, à la fois à des inserts disponibles dans le commerce d’où la membrane a été retirée 4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21 , ainsi qu’aux inserts conçus sur mesure fabriqués par impression 3D 1,11,15,17,20 ou moulage par injection 9,22. Cependant, la plupart d’entre eux sont encore loin de ressembler au BM natif en termes d’épaisseur, où les répliques vont de centaines11,18 à quelques micromètres 5,10,14,21,22. Beaucoup d’entre eux nécessitent également une formation complexe et/ou des méthodes de fixation manuelles 1,7,13,14,18,19,21, ce qui rend la mise à l’échelle et la réplication difficiles dans d’autres laboratoires.
Ici, nous présentons une méthode simple pour former et fixer une membrane de soie aux inserts et montrons comment cultiver des cellules de chaque côté de la membrane. Les membranes de soie sont formées par l’auto-assemblage de la protéine FN-4RepCT (FN-silk) à l’interface liquide-air d’une solution debout16,17. FN-silk est une version courte produite de manière recombinante de Major Ampullulate Spidroin 1 d’Euprosthenops australis, fonctionnalisée avec un motif RGD dérivé de la fibronectine23. Il a été démontré qu’il s’assemble en matrices fibrillaires qui favorisent l’adhésion, la croissance et la migration cellulaires 15,16,17,23,24,25. La méthode de fixation de la membrane sur l’insert repose sur l’adhérence spontanée et s’est avérée adaptée aux inserts disponibles dans le commerce dont la membrane a été retirée16, ainsi qu’aux inserts imprimés en 3D à partir d’acide polylactique (PLA)17 et de Dental LT15. Cet article détaille comment cette méthode est utilisée pour les inserts imprimés à partir de Dental LT. Une fois que les membranes FN-silk ont été fixées aux inserts, ils peuvent, en substance, être traités comme des inserts de culture tissulaire commerciaux standard. En bref, nous présentons une méthode simple pour générer des modèles in vitro plus pertinents de barrières tissulaires en remplaçant les membranes plastiques par une membrane FN-soie à base de protéines.
Le protocole décrit ici décrit un moyen simple de fabriquer des inserts de culture cellulaire biologiquement pertinents. Il commence par l’impression des inserts, suivi de la formation et de la fixation des membranes FN-soie, et se termine par la démonstration de comment les cellules peuvent être ensemencées à la fois sur les côtés apical et basal de la membrane. Il y a une étape vraiment critique dans ce protocole pour assurer le succès à long terme des cultures cellulaires et c’est l’abaissement et le soulèvement des inserts sur la membrane. L’exécution réussie de ces étapes permettra d’obtenir un système de culture à insertion de membrane de soie capable de résister à la culture cellulaire de la même manière que les systèmes disponibles dans le commerce avec des membranes synthétiques. Pour ce faire, des rails de guidage ont été mis en place sur les côtés des inserts conçus sur mesure afin d’éviter qu’ils ne soient abaissés en biais ou déplacés latéralement dans le puits, ce qui entraînerait une adhérence inégale de la membrane, générant des points faibles et par conséquent des fuites. Il est courant que des problèmes mineurs surviennent lors du premier suivi d’un protocole. Pour aider le nouvel utilisateur à les contourner, s’il en fait l’expérience en suivant le protocole présenté ci-dessus, nous avons décrit les problèmes potentiels et leurs solutions dans le tableau 3.
La membrane elle-même s’est avérée bénéfique pour la modélisation de différents tissus barrières (vue d’ensemble dans le tableau 2) ; Cependant, il convient de souligner que la résine utilisée pour imprimer les inserts ici n’a pas été testée de manière approfondie pour son effet sur la viabilité d’autres types de cellules. Bien que nous n’ayons pas rencontré de tels problèmes jusqu’à présent, il est possible que la résine puisse affecter négativement la viabilité et la croissance de certaines cellules sensibles. Il est donc recommandé d’effectuer un test de viabilité similaire à celui présenté ici afin de vérifier la compatibilité de la résine avec chaque type de cellule utilisé. En cas de cytotoxicité, un protocole de durcissement et/ou de lixiviation plus approfondi doit être établi pour empêcher les monomères non durcis de s’échapper au fil du temps et d’endommager les cellules. Un exemple d’un tel protocole, qui a été utilisé pour la résine utilisée pour imprimer les encarts à l’intérieur de ce protocole, se trouve dans le fichier supplémentaire 2. Ce protocole a déjà été utilisé pour préparer des inserts pour la culture de l’endothélium cérébral bEnd.3 sur des membranes de soie jusqu’à 8 jours15.
Le principal avantage de la méthode présentée dans ce travail est qu’elle offre un moyen simple de remplacer les membranes plastiques actuelles sur les inserts de culture tissulaire et, par conséquent, d’améliorer les modèles de culture tissulaire statique. La principale limitation est que l’utilisateur a besoin d’accéder à l’équipement d’impression 3D ou de passer du temps dans une installation pour imprimer ses inserts. Cependant, si nécessaire, cela pourrait être contourné en utilisant des inserts de culture tissulaire commerciaux après avoir retiré leurs membranes. De plus, bien que les membranes de soie, en substance, puissent être utilisées comme inserts de culture tissulaire réguliers, elles sont plus minces et de composition protéique, et donc plus sensibles que leurs homologues commerciaux synthétiques actuels. Par conséquent, ils nécessitent une manipulation plus soigneuse de la part des utilisateurs et doivent être maintenus humides pour maintenir leur élasticité. Il convient de noter que les membranes peuvent résister à l’étirement et au gonflage16,17, ce qui les rend adaptées, par exemple, pour imiter le mouvement de la respiration. Même ainsi, il est probable que les nouveaux utilisateurs briseront certaines membranes dans les premières étapes, mais à mesure que leur expérience de manipulation des membranes augmente, le taux de réussite devrait augmenter. Si des problèmes persistent, l’utilisateur doit se référer au Tableau 3 pour le dépannage.
Au cours de la dernière décennie, plusieurs alternatives aux inserts en plastique commerciaux ont été présentées (tableau 1), et chaque fois que les performances des cultures cellulaires ont été comparées, les nouvelles membranes plus pertinentes sur le plan biologique ont donné de meilleurs résultats que leurs homologues en plastique commerciaux 2,5,6,7,14,22. Cela a été principalement observé en termes d’amélioration de la fonction barrière 2,5,6,7,14,22, mais aussi dans la formation d’une croissance cellulaire plus native14 et une augmentation des interactions à travers la membrane dans les systèmes de co-culture 7 . Cette tendance a déjà été observée pour les membranes FN-soie lors de l’établissement d’un modèle de paroi de vaisseau sanguin. Dans cette étude, le HDMEC et les cellules musculaires lisses (SMC) ont été cultivés de part et d’autre de la membrane. Il a été démontré que les SMC sécrétaient une ECM plus épaisse lorsqu’ils étaient co-cultivés avec le HDMEC sur les membranes FN-silk par rapport aux membranes PET commerciales. De même, le HDMEC a établi une barrière plus étanche sur les membranes FN-silk17. L’amélioration des résultats de la culture cellulaire est probablement due à une meilleure communication cellulaire et à des conditions de culture plus proches de celles des in vivo. La membrane FN-silk se rapproche beaucoup plus de la BM native en termes d’épaisseur, de structure et de propriétés mécaniques. La BM native est comprise entre 20 nm et 3 μm22 mince, les membranes PET 10 μm et les membranes FN-soie autour de 1 μm, se situant ainsi bien dans la gamme native. La structure de la membrane FN-soie est également nanofibrillaire16, tout comme la BM22 native, tandis que la membrane PET est constituée de plastique avec des pores gravés sur traces, généralement entre 0,4 μm et 8 μm de diamètre7. Les membranes en PET sont également beaucoup plus rigides que les BM, avec un module de Young d’environ 2 GPa, par rapport à la BM qui varie de kPa à MPa, mais est généralement citée autour de 250-500 kPa22. Les membranes en soie FN ont un module de Young de 115 kPa16, ce qui correspond aux conditions natives. Il convient également de noter qu’une fois que les cellules sont cultivées sur la membrane, leur force devient le facteur dominant, et non la membrane elle-même17. En fin de compte, il convient également de noter que la fonctionnalisation intégrée de la protéine FN-soie garantit que les cellules adhèrent directement à la membrane et qu’en tant que telle, un revêtement ne sera pas nécessaire. Pour les membranes TEP, il est souvent standard d’enrober d’une protéine ECM pour assurer une bonne adhésion cellulaire7.
Lorsque l’on compare la membrane FN-soie avec d’autres approches utilisées pour remplacer la membrane PET (vue d’ensemble dans le tableau 1), le principal avantage de notre méthode est l’utilisation de la protéine de soie fonctionnalisée produite par recombinaison. Cela garantit la reproductibilité et des conditions de culture définies, contrairement à d’autres matériaux d’origine animale à base de protéines tels que le collagène. Notons encore que la fonctionnalisation de la protéine garantit qu’aucun enrobage n’est nécessaire car les cellules adhèrent bien aux membranes puisqu’il est17. De plus, la production de membranes à base de soie décrite ici est basée sur l’auto-assemblage et ne nécessite aucune configuration complexe ni l’utilisation de produits chimiques agressifs, contrairement à de nombreuses autres techniques qui reposent, par exemple, sur l’électrofilage. L’adhérence spontanée de la membrane à l’insert élimine également le besoin de manipulation manuelle associée aux inserts en deux parties, au collage et aux bagues de montage en silicone, simplifiant ainsi la mise à l’échelle et permettant une reproductibilité facile dans n’importe quel laboratoire. En plus de la facilité de production, notre méthode est facile à adapter aux besoins expérimentaux de l’utilisateur puisque différents matériaux d’insert peuvent être utilisés et que l’épaisseur de la membrane peut être ajustée en ajustant la concentration en soie de la solution initiale16. Enfin, ce protocole peut donner, à notre connaissance, la membrane autoportante la plus mince à ce jour, attachée à un insert de culture tissulaire, permettant la ressemblance la plus proche avec la membrane basale native.
Le protocole de formation et de manipulation des membranes de soie présenté ici est simple à utiliser pour toute personne habituée à travailler avec des inserts de culture tissulaire dans un laboratoire de culture cellulaire. Il s’agit d’un moyen simple de passer des membranes en plastique à une homologue plus proche de celle in vivo, ce qui permet de générer des modèles de tissus plus pertinents à l’aide de divers types de cellules (tableau 2). Les membranes de soie peuvent supporter la culture cellulaire sur leurs faces apicales ou basales ainsi que les co-cultures de différents types de cellules bilatéralement17. Les modèles de tissus barrières développés sur les membranes en soie peuvent être utilisés pour la même gamme d’applications que les inserts de culture tissulaire, y compris les criblages de médicaments et les études de perméation et d’infection. Dans les cas où la diaphonie entre différents types de cellules est intéressante, il a été démontré qu’elles surpassent les inserts TC en raison de leurs propriétés plus similaires in vivo 17.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Spiber Technologies AB pour avoir fourni la protéine de soie d’araignée fonctionnalisée recombinante et Eline Freeze pour l’impression d’une grande partie des inserts imprimés en 3D.
CHEMICALS | |||
Alexa Fluor 488 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A-21121 | Goat anti-mouse, Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A12379 | Dilution 1:400 |
anti-ZO-1 (1A12) antibody | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | 33-9100 | Mouse anti-human, Monoclonal, Dilution 1:200 |
Dextran, Alexa Fluor 680; 3,000 MW, Anionic | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | D34681 | Diluted 2,5% (w/v) in 200 ul of culture medium |
DMEM/F-12 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 31330095 | Supplemented with 5% v/v FBS and 1% v/v Penicillin-Streptomycin |
Ethanol | Solveco | 1326 | 70% (CAS-no 64-17-5) |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, United States | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 16140071 | |
FN-silk | Spiber technologies AB | Store at -80 °C | |
Isopropanol, EMPARTA ACS analytical reagent | Supelco | 1096342511 | ≥99.5% (CAS-no 67-63-0) |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
PBS | Swedish Veterinary Agency / Statens veterinärmedicinska anstalt | 992420 | without Ca and Mg, filtered |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 11548876 | |
MATERIAL | |||
Dental LT Clear Resin | Denthouse | #DLCL-01 | |
HaCaT cells | CLS | 300493 | |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24-well | Fisher Scientific | 10604903 | |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 48-wel | Fisher Scientific | 10644901 | |
TC insert, for 24-well plates, PET, transparent | Sarstedt | 83.3932.041 | pore size: 0.4 µm |
ThinCert Cell Culture Inserts, translusent membrane (PET) | Greiner | 662640 | pore size: 0.4 µm |
EQUIPMENT | |||
EVOM meter with chopsticks | World Precision Instruments (WPI) Germany, GMBH | ||
Form 3B | FormLabs | ||
Form Wash | FormLabs | ||
Form Cure | FormLabs | ||
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisherbrand | ||
Inverted fluorescence microscope Eclipse Ti | Nikon | ||
Inverted fluorescence microscope DMI6000 B | Leica | ||
Laminar flow hood Ninosafe, class II | Labolutions | ||
Midi CO2 Incubator, 40 L | Thermo Scientific |