La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) peut caractériser la dynamique des protéines structurelles d’une manière spécifique aux résidus. Nous fournissons un protocole pratique pour l’enregistrement d’expériences de relaxation RMN 15N R1 et R2 et d’expériences à effet Overhauser hétéronucléaire {1H}-15N, sensibles à l’échelle de temps de la picoseconde à la nanoseconde.
La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) permet d’étudier les protéines en solution et à des températures physiologiques. Fréquemment, les groupes amides du squelette protéique ou les groupes méthyle dans les chaînes latérales sont utilisés comme rapporteurs de la dynamique structurelle des protéines. Une étude de la dynamique structurale du squelette protéique des protéines globulaires sur des échantillons marqués 15N et entièrement protonés fonctionne généralement bien pour les protéines d’un poids moléculaire allant jusqu’à 50 kDa. Lorsque la deutération de la chaîne latérale en combinaison avec la spectroscopie optimisée de relaxation transverse (TROSY) est appliquée, cette limite peut être étendue jusqu’à 200 kDa pour les protéines globulaires et jusqu’à 1 MDa lorsque l’accent est mis sur les chaînes latérales. Lorsque des protéines intrinsèquement désordonnées (IDP) ou des protéines avec des régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont étudiées, ces limitations de poids ne s’appliquent pas mais peuvent aller bien au-delà. La raison en est que les PDI ou IDR, caractérisés par une grande flexibilité interne, sont souvent découplés dynamiquement. Diverses méthodes de RMN offrent des informations à résolution atomique sur la dynamique des protéines structurelles sur une large gamme d’échelles de temps, de la picoseconde à l’heure. Les mesures de relaxation standard 15N permettent d’obtenir un aperçu de la flexibilité interne d’une protéine et de caractériser la dynamique du squelette protéique sur une échelle de temps rapide de l’ordre de la pico à la nanoseconde. Cet article présente un protocole pratique pour la mise en place et l’enregistrement d’expériences de RMN 15N R1, R2 et d’effets Overhauser hétéronucléaires (hetNOE). Nous présentons des données exemplaires et expliquons comment les interpréter simplement qualitativement avant toute analyse plus sophistiquée.
La fonction d’une protéine est déterminée non seulement par sa structure tridimensionnelle, mais aussi par sa dynamique structurelle, englobant sa flexibilité interne et les transitions structurelles entre les différentes conformations que la protéine adoptera. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) permet d’étudier la dynamique structurale des protéines dans la solution 1,2,3. Les développements récents de la RMN à l’état solide détectée par des protons permettent également de caractériser la dynamique des protéines dans un état moins soluble, comme, par exemple, une membrane bicouche lipidique 4,5,6. En RMN en solution, la dynamique structurelle du squelette protéique et des chaînes latérales protéiques peut être étudiée. Pour une protéine globulaire, une étude de dynamique structurale du squelette protéique peut être réalisée jusqu’à 50 kDa une fois que la protéine est marquée isotopiquement à 15N. Lorsque la deutération à chaîne latérale et la spectroscopie optimisée de relaxation transversale (TROSY) sont utilisées, cette limite peut être étendue jusqu’à 200 kDa 7,8. Lorsque l’accent est mis sur la dynamique de la chaîne latérale, la gamme de protéines et de complexes accessibles peut être étendue jusqu’à 1 MDa 2,9.
Les limitations de poids nommées ne s’appliquent pas aux protéines intrinsèquement désordonnées (IDP), qui présentent souvent une dynamique intrinsèque élevée. Plus de 30 % du protéome eucaryote est constitué d’IDP ou de régions intrinsèquement désordonnées (IDR)10,11,12,13. Ils jouent un rôle central dans de nombreux processus cellulaires, tels que la transduction et la transcription du signal1, et sont fréquemment impliqués dans la séparation de phase intracellulaire 14,15,16,17. Les PDI n’ont pas de structure native tridimensionnelle (3D) bien définie dans des conditions physiologiques et ont un paysage énergétique faiblement canalisé ou accidenté17,18. En raison d’une faible hydrophobie et d’une forte répulsion électrostatique répartie sur l’épine dorsale des IDP ou des IDR, il manque une force motrice pour le pliage en une structure rigide19. Les IDP adoptent fréquemment une conformation pliée lorsqu’elles sont complexes avec d’autres partenaires de liaison 10,20,21. De plus, les modifications post-traductionnelles (MTP) élargissent les possibilités de pliage des IDP ou des IDR22,23. Le mauvais repliement des PDI a été identifié comme une cause de diverses maladies, y compris les maladies neurodégénératives 15,24,25,26.
Les PDI et les IDR font preuve d’une grande flexibilité interne 21,27,28. Des ensembles conformationnels montrant la variation des positions atomiques et des angles dièdres ont été dérivés de simulations de dynamique moléculaire et de contraintes obtenues à partir de données expérimentales 29,30,31,32. En raison de la dynamique et du désordre qui en résulte à l’état gelé, la densité électronique diffuse rend difficile leur caractérisation structurelle à l’aide de méthodes de pointe en biologie structurale, telles que la cryo-EM ou la cristallographie aux rayons X. De plus, les conditions de cristallisation ou les techniques de préparation d’échantillons pour des expériences à des températures cryogéniques peuvent avoir un impact sur l’espace conformationnel expérimenté par les PDI. Cependant, la RMN en solution fonctionne bien pour les protéines hautement dynamiques et est donc bien adaptée à l’étude des IDP16, 20, 22, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38.
Comme nous l’avons présenté ci-dessus, la RMN en solution offre diverses techniques pour étudier la dynamique interne des protéines sur une large gamme d’échelles de temps (Figure 1), principalement basées sur la relaxation de spin 31,33,38,39,40,41,42.
La relaxation de spin des noyaux 15N dans les groupes amides du squelette protéique est induite par des changements d’orientation de l’angle de liaison 1 H-15N dus à la dynamique interne des protéines et aux mouvements collectifs (y compris, le cas échéant, la diffusion rotationnelle)27,43,44,45,46,47,48,49,50,51. À des échelles de temps plus courtes que le temps de corrélation de rotation τR (le temps dont la molécule a besoin pour tourner d’un radiant, également appelé temps de corrélation de culbutage global), l’anisotropie de décalage chimique (CSA) et le couplage dipolaire (D) sont actifs et ne sont pas moyennés par la diffusion rotationnelle de la protéine. La dynamique interne du squelette protéique, comprenant les variations des angles de liaison, les réorientations des liaisons et le culbutage rotationnel, induit des fluctuations stochastiques du CSA et du tenseur de couplage dipolaire, entraînant une variation du champ magnétique local, conduisant finalement à une relaxation de spin RMN 47,48,52,53. Ces fluctuations peuvent être décrites par une fonction de corrélation globale. La transformée de Fourier de la fonction de corrélation globale est appelée fonction de densité spectrale. Dans la théorie semi-classique de la relaxation de Redfield, les constantes de vitesse de relaxation RMN peuvent être décrites par des combinaisons linéaires de ces fonctions de densité spectrale54.
Les expériences de relaxation RMN 15N développées au début des années 1990 comprennent des expériences nucléaires à effet Overhauser 15N R1, R1ρ et {1H}-15N, sensibles à l’échelle de temps de la nanoseconde (ns) picoseconde (ps) rapide, plus rapide que le temps de corrélation de rotation τR de la protéine 45,55,56,57. Pour caractériser la dynamique du squelette plus lente que le temps de corrélation rotationnelle τR, on utilise des expériences dites de dispersion de relaxation, R1ρ et des expériences de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) sensibles à la dynamique microseconde (μs) – milliseconde (ms) 44,46,58,59,60,61. Des dynamiques inférieures à la microseconde peuvent être capturées par la RMN 15N par transfert de saturation par échange chimique (CEST)62, la spectroscopie d’échange (EXSY, millisecondes à secondes) ou la RMN en temps réel (RT) (secondes en heures)63,64. L’effet PRE (paramagnetic relaxation enhancement) des sondes paramagnétiques, ainsi que des couplages dipolaires résiduels (RDC), peut être utilisé pour évaluer toute la gamme de dynamiques ps à ms 65,66,67,68.
Figure 1 : Échelles de temps de la dynamique du squelette protéique et fenêtre temporelle sensible de différentes expériences de dynamique RMN. La RMN offre une variété de méthodes pour caractériser la dynamique du squelette protéique sur une large gamme d’échelles de temps. Les différents mouvements subis par le squelette protéique sont indiqués à leurs échelles de temps respectives. Le temps de corrélation rotationnelle de la protéine, τR, est le temps dont la protéine a besoin pour une rotation globale (d’un radiant). Des mouvements plus rapides que le temps de corrélation rotationnelle de la protéine, τR, peuvent être associés à la flexibilité interne de la protéine. Diverses expériences de RMN et leur sensibilité aux échelles de temps respectives sont indiquées sous la flèche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le protocole ci-dessous décrit la mise en place d’expériences de relaxation RMN par Lakomek et al.69 et Stief et al.70, à l’aide d’un schéma de détection de cohérence quantique unique (HSQC) hétéronucléaire à sensibilité améliorée. Avant de procéder à la mise en œuvre expérimentale, un très bref aperçu des expériences de relaxation de spin RMN et de relaxation RMN est donné. En raison de contraintes de taille et pour que ce protocole reste compréhensible, cette vue d’ensemble doit rester simpliste (et donc incomplète).
La relaxation longitudinale ou en spin-réseau, caractérisée par le temps T1 ou la constante de vitesse R1 = 1/ T1 , décrit le retour de l’aimantation à l’équilibre de Boltzmann. À l’équilibre, l’aimantation est alignée le long de l’axe du champ magnétique externe, qui définit l’axe z du cadre du laboratoire. Les densités spectrales aux fréquences de Larmor élevées (1H) et petites (15N) (les fréquences de résonance RMN, par exemple, 600 MHz pour 1H pour un aimant de 14,1 Tesla) et les combinaisons linéaires de ces fréquences de Larmor contribuent à la relaxation 15N R1 , qui est caractérisée par les constantes de vitesse 15N R1 mesurées en rad·s-1. Les mouvements sur les échelles de temps sont inverses à ces fréquences de Larmor ; ainsi, les mouvements sur l’échelle de temps de la picoseconde à la nanoseconde contribuent à la constante de vitesse de relaxation R1. Pour les molécules qui présentent un culbutage global et où un temps de corrélation de rotation peut être défini, la courbe R1 (T1) montre un maximum (minimum) pour ωτR = 1, avec la corrélation de rotation τR et la fréquence de Larmor ω du spin considérée. Si plusieurs fréquences de Larmor contribuent, celle avec la fréquence la plus basse est la dominante, par exemple, ωN dans le cas de 15N R1. Le régime de mouvement rapide (ωτR beaucoup plus petit que 1) s’applique aux petites molécules qui culbutent très rapidement et aux faibles champs magnétiques et à faible viscosité. Le régime du ralenti (ωτR beaucoup plus grand que 1) est valable pour les molécules plus grosses qui culbutent plus lentement et pour les champs magnétiques élevés et la viscosité élevée.
Les protéines globulaires repliées montrent un culbutage global dans la solution, et un temps de corrélation de rotation peut être attribué. Cependant, le concept de culbutage global n’est plus valable pour les protéines intrinsèquement désordonnées et diffère souvent de l’attribution d’un seul temps de corrélation rotationnelle. Ici, le temps de corrélation interne spécifique au résidu devient plus critique.
La séquence d’impulsions décrite mesurant des taux de relaxation de 15N R1 (figure 2) est basée sur une expérience de lecture HSQC à sensibilité améliorée avec une détection écho/anti-écho pour la détection en quadrature 69,70,71. Des gradients courts de force et de longueur variables sont utilisés pour la sélection de la cohérence et une meilleure suppression de l’eau70. Pendant ce temps, la polarisation longitudinale de 15N se détendra. Des temps de décroissance plus longs entraînent une réduction des intensités dans les plans 2D associés à ce spectre pseudo-3D (les points de données de retard sont enregistrés dans la troisième dimension). Un élément de boucle, décrit ci-dessous, est exécuté un nombre croissant de fois pour des temps de relaxation plus longs. Comme la relaxation croisée entre l’anisotropie de décalage chimique 15N (CSA) et le couplage dipolaire 1H et 15N (D) est également active pendant le retard de relaxation, une impulsion centrale I-BURP-2 180°72, sélective sur les protons amides, est nécessaire pour recentrer la contribution par relaxation corrélée croisée (qui, si elle n’était pas recentrée, conduirait à des constantes de vitesse 15N R1 asymétriques et erronées).
Figure 2 : Schémas de séquences d’impulsions RMN pour déterminer les constantes de vitesse de relaxation RMN. (A) 15N R1ρ, (B) 15N R1, et (C) expérience hetNOE, à l’aide d’un schéma de lecture HSQC à sensibilité améliorée69,70. Les impulsions de 90°(x) sont visualisées par des rectangles étroits et les impulsions de 180°(x) par des rectangles larges, sauf indication contraire. Le cycle de phase suivant est appliqué : φ6 = y, y, -y, -y ; φ7 = y, -y, φrec = y, -y, -y, y. La détection en quadrature est obtenue en inversant la polarité du gradient G5 et le cycle de phase de φ7 (détection Echo/Anti-Echo). (A) Expérience 15N R1ρ : Le rectangle noir représente le spin-lock, dont la durée varie pour acquérir différents retards de relaxation. Les triangles avant et après le spin-lock indiquent les impulsions de forme adiabatique qui alignent l’aimantation le long de l’axe du champ magnétique effectif Beff. G10 est un gradient optionnel pour éviter l’amortissement par rayonnement de l’aimantation de l’eau pendant la phase d’évolution. (B) Expérience 15N R1 : La partie entre crochets montre l’élément de boucle de la séquence, répété un n fois pour correspondre au retard de relaxation souhaité. (C) Le schéma d’impulsions hetNOE est similaire à la seconde moitié des schémas d’impulsions R1 et R1ρ, à savoir le temps d’évolution t1 et l’élément de détection HSQC. Cependant, l’aimantation 15N est excitée directement sans aucun INEPT. La saturation de l’aimantation du proton (pour obtenir une relaxation croisée entre 1H et 15N) est obtenue par un train de 180 impulsions (1H) appliquées pendant au moins 5 s. Un retard en repos de mêmes longueurs (ici, 5 s) sans aucun train d’impulsions est appliqué pour l’expérience de référence. G5 est un gradient facultatif pour empêcher l’amortissement des rayonnements, et l’inversion de polarité du gradient G4, en combinaison avec la phase φ7 = y, -y, -y, y, permet d’obtenir une détection en quadrature. Les étapes de transfert de magnétisation, représentées par les opérateurs de produit, sont marquées en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La constante de vitesse de relaxation R2 décrit la relaxation de la polarisation transversale (dans le plan xy orthogonal au champ magnétique externe) due à la perte de cohérence de phase entre le spin, conduisant à une décroissance de l’aimantation détectable53,54. La fonction de densité spectrale aux hautes et petites fréquences contribue à R2, similaire à R1. Cependant, la plus grande contribution à R2 provient de la densité spectrale à fréquence nulle. Pour cette raison, R2 est très sensible au culbutage rotationnel, décrit par le temps de corrélation rotationnelle τR, qui est de l’ordre de quelques ns pour une petite protéine globulaire à température ambiante. Ainsi, les mouvements plus lents de l’épine dorsale dans les centaines de ps à faible régime ns contribuent le plus. La dynamique d’échange du squelette qui provoque une modulation de la partie isotrope du tenseur de décalage chimique des noyaux 15N, en principe, ajoute une contribution d’échange R2ex aux constantes de vitesse R2 43,44,49,60,61. Dans les expériences décrites, la contribution de R2ex est supprimée par un verrou de spin qui recentre la dynamique plus lentement que la fréquence circulaire inverse du verrou de spin. Le spin-lock est une longue impulsion radiofréquence à onde continue qui maintient l’aimantation alignée le long de l’axe du champ magnétique effectif Beff (la somme vectorielle du champ de spin-lock ω1 et du décalage chimique par rapport à la fréquence porteuse 15N (voir ci-dessous)). La relaxation de l’aimantation alignée le long de l’axe B1,eff est appelée relaxation R1ρ, qui a une composante R1 et une composante R2. À l’aide de la formule (1), R2 peut être calculé à partir de R1ρ et R144,73 :
(1).
L’angle entre l’axe du champ magnétique effectif Beff et le champ magnétique externe B0 est . ω1 est l’amplitude RF du spin-lock et Ω le décalage chimique entre le décalage chimique 15N du résidu correspondant et la fréquence porteuse 15N 44,73.
Le schéma d’impulsions R1ρ (figure 2A, 70) est très similaire au schéma 15N R1 , à l’exception du retard de relaxation. Pour mesurer les taux de relaxation de 15N R1ρ , le spin-lock doit être actif après que l’aimantation a été alignée le long de l’axe de champ effectif Beff par une impulsion adiabatique de la même amplitude de radiofréquence (RF) que le spin-lock. La longueur du spin-lock sera modifiée pour obtenir les différents délais de relaxation.
L’effet de Overhauser nucléaire {1H}-15N à l’état stationnaire (1 H-15N NOE), appelé hetNOE dans ce qui suit, est le rapport entre le taux de relaxation croisée et le taux de relaxation longitudinale de 15N. Elle conduit à une réduction de la polarisation à l’état stationnaire sur 15N due à la relaxation croisée avec le proton lors de la saturation de la polarisation du proton 45,53,54,74,75. La relaxation croisée dépend des fonctions de densité spectrale de la somme et de la différence des fréquences de Larmor 1H et 15N. Par conséquent, l’hetNOE est sensible à la fois à la dynamique picoseconde rapide (< 100 ps) et à la dynamique ps-ns (en raison de sa dépendance R1). La séquence69 (Figure 2C) est basée sur une lecture HSQC à sensibilité améliorée avec gradients Echo/Anti-Echo pour la détection en quadrature. Pour la saturation de l’aimantation des protons et l’hetNOE qui en résulte, l’aimantation des protons à l’équilibre est inversée puis saturée par des impulsions rapides de 180° pendant environ 5 fois les 15 N T1. Pour l’expérience de référence, le retard de récupération est égal au retard de saturation mais sans le train d’impulsions de 1H à 180°. Un délai supplémentaire de D1 = 2 s est ajouté pour l’expérience de référence et celle avec une saturation de 1H. Les deux expériences sont enregistrées l’une après l’autre et ne diffèrent que par l’application d’impulsions de 1H à 180° (saturation) ou non (référence). Le rapport des intensités spectrales enregistrées dans l’expérience avec une saturation de 1H divisé par les intensités de l’expérience de référence (sans le train d’impulsions de protons de 180°) donne la valeur {1H}-15N NOE (hetNOE).
Le protocole suivant décrit la mise en place d’expériences de relaxation RMN par Lakomek et al.69 et Stief et al.70. Nous nous concentrons sur les séquences d’impulsions RMN à l’aide d’un schéma de détection HSQC à sensibilité améliorée. Les expériences 15N R1 et R1ρ sont mises en œuvre comme décrit en détail par Stief et al.70, et l’expérience hetNOE est décrite par Lakomek et al.69.
Ce protocole décrit la mise en place d’expériences de relaxation RMN 15N par Lakomek et al.69 et Stief et al.70. Nous nous sommes concentrés sur les séquences d’impulsions RMN à l’aide d’un schéma de détection HSQC à sensibilité améliorée. Les expériences 15N R1 et R1ρ sont mises en œuvre comme décrit en détail par Stief et al.70, et l’expérience hetNOE est décrite par …
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Melinda Jaspert et Kevin Bochinsky pour les discussions utiles. N.L. remercie la Fondation allemande pour la science pour son financement par le biais du programme Heisenberg (numéro de subvention DFG 433700474). Ce travail est également soutenu par le projet « Virological and immunological determinants of COVID-19 pathogenesis – lessons to get prepared for future pandemics » (KA1-Co-02 « COVIPA »), une subvention du Fonds d’initiative et de mise en réseau de l’Association Helmholtz. Nous reconnaissons l’accès généreux au Centre de RMN biomoléculaire de Jülich-Düsseldorf, géré conjointement par le Forschungszentrum Jülich et l’Université Heinrich Heine de Düsseldorf (HHU).
Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer | Bruker | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html | NMR experiments conducted |