Summary

Modèle in vitro pour l’étude de la différenciation et des modifications de la multi-omique sur des cellules épithéliales des voies respiratoires murines stimulées par un extrait de fumée de cigarette

Published: July 12, 2024
doi:

Summary

Ici, nous décrivons un modèle in vitro pour isoler et différencier les cellules épithéliales des voies respiratoires murines, en nous concentrant sur leur acclimatation à l’extrait chronique de fumée de cigarette (ECS). Le modèle pourrait être utilisé pour caractériser de manière exhaustive l’impact multi-omique de l’ECS, ce qui pourrait donner un aperçu des réponses cellulaires en cas d’exposition chronique à la fumée.

Abstract

La bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC) est largement attribuée à l’exposition à la fumée de tabac. L’étude de la façon dont les cellules épithéliales des voies respiratoires s’adaptent fonctionnellement à la fumée de tabac est cruciale pour comprendre la pathogenèse de la BPCO. La présente étude visait à mettre en place un modèle in vitro utilisant des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines pour imiter l’impact réel de la fumée de tabac. Contrairement aux lignées cellulaires établies, les cellules primaires conservent davantage de propriétés in vivo, notamment les modèles de croissance, le vieillissement et la différenciation. Ces cellules présentent une réponse inflammatoire sensible et une différenciation efficace, représentant ainsi étroitement les conditions physiologiques. Dans ce modèle, des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines ont été cultivées pendant 28 jours sous une interface air-liquide avec une concentration optimale d’extrait de fumée de cigarette (CSE), ce qui a conduit à la transformation d’une monocouche de cellules indifférenciées en un épithélium cylindrique pseudostratifié, indiquant une acclimatation au CSE. Des analyses multi-omiques complètes ont ensuite été appliquées pour élucider les mécanismes par lesquels la CSE influence la différenciation des cellules basales des voies respiratoires. Ces informations permettent de mieux comprendre les processus cellulaires qui sous-tendent la progression de la BPCO en réponse à l’exposition à la fumée de tabac.

Introduction

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une affection pulmonaire hétérogène aux caractéristiques complexes, tandis que les patients atteints de BPCO ont progressivement tendance à être plus jeunes1. Le tabagisme, principal facteur de risque de la BPCO2, a un impact profond sur les cellules épithéliales des voies respiratoires, qui servent de barrière initiale contre la fumée de tabac. Malgré cette association connue, les mécanismes détaillés par lesquels la fumée de tabac induit des changements dans les cellules épithéliales des voies respiratoires restent insuffisamment explorés. Une compréhension approfondie de ces altérations moléculaires est essentielle pour identifier des marqueurs diagnostiques précoces et des cibles thérapeutiques de la BPCO.

Pour combler cette lacune, nous avons développé un nouveau modèle in vitro utilisant des cellules épithéliales murines des voies respiratoires. Ces cellules ont été soumises à une stimulation à long terme avec de l’extrait de fumée de cigarette (CSE), ce qui nous a permis de surveiller les changements cellulaires dynamiques et d’explorer les changements dans les cellules épithéliales des voies respiratoires sous stimulation à long terme du tabac et le mécanisme sous-jacent. Dans ce modèle, transwell a été utilisé pour fournir l’interface air-liquide des cellules épithéliales des voies respiratoires, et l’extrait de fumée de cigarette a été stimulé au stade précoce de la différenciation des cellules épithéliales jusqu’à la fin de la différenciation à 28 jours. Des études antérieures n’ont porté que sur la différenciation et la stimulation à court terme des cellules épithéliales des voies respiratoires (dominance de la lignée cellulaire). Ils étaient limités à une seule voie réglementaire 3,4,5,6. Cependant, le protocole présenté ici utilise des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires de souris et optimise le processus d’extraction cellulaire pour une meilleure activité cellulaire que les méthodes précédentes de culture de cellules épithéliales des voies respiratoires. Ce modèle se concentre sur les altérations de la différenciation cellulaire ainsi que sur des analyses transcriptomiques, protéomiques, métabolomiques et épigénomiques complètes. En utilisant l’immunofluorescence et des techniques multi-omiques avancées, nous avons cherché à élucider les réponses cellulaires des cellules épithéliales des voies respiratoires à l’exposition chronique à la fumée de tabac, contribuant ainsi à une compréhension plus approfondie de la pathogenèse de la BPCO. Ce modèle peut être utilisé pour explorer les changements dans le modèle de différenciation des cellules épithéliales des voies respiratoires et son mécanisme causé par la stimulation à long terme de divers polluants.

Protocol

Le protocole global nécessite 44 jours, dont 1 jour pour la préparation des cellules épithéliales des voies respiratoires isolées des trachées murines, 15 jours pour la prolifération cellulaire et 28 jours pour la stimulation CSE à l’interface air-liquide. Tous les animaux de laboratoire sont hébergés dans la salle des animaux de barrière SPF du Centre d’expérimentation animale de l’Université médicale de la capitale et ont été examinés et approuvés par le Comité d’éthique de l’expérimentat…

Representative Results

DifférenciationLes cellules épithéliales des voies respiratoires murines se sont différenciées avec succès après culture à une interface air-liquide avec un milieu de différenciation pendant 28 jours. La présence de cellules ciliées et caliciformes a été démontrée par un dosage par immunofluorescence d’un marqueur de cils acétylé α-tubuline (vert ; Graphique 3A) et le marqueur de cellules caliciformes Mucin5AC, respectivement6 (rouge ; <strong class=…

Discussion

La BPCO est une maladie inflammatoire chronique courante des voies respiratoires. L’exposition à la fumée de tabac entraîne une inflammation chronique des voies respiratoires, un remodelage des voies respiratoires et une destruction structurelle des poumons, qui est le résultat de l’interaction de diverses cellules structurelles et cellules immunitaires10. En tant que première ligne du système immunitaire inné dans les poumons, les cellules épithéliales des voies respiratoires jouent …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82090013).

Materials

100x Penicillin/Streptomycin solution Gibco 15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile BIOFIL TCS016012
40 µm Cell Strainer Falcon 352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution Gibco R01510
acetylated α-Tubulin CST #5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb  cellsignal #5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit Stemcell 05426
Anti-pan Cytokeratin antibody abcam ab7753
Cigarette Marlboro
Claudin3 immunoway YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas Sigma DN25
Ham’s F-12 Sigma-Aldrich N6658
Heparin Solution  Stemcell 07980
Hydrocortisone Stock Solution Stemcell 07925
Mucin 5AC abcam ab212636
Occludin proteintech 27260-1-AP
PBS Cytosci CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution Gibco 15140122
PneumaCult-ALI
Basal Medium
Stemcell 05002 
PneumaCult-ALI 10x Supplement Stemcell 05003 
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement Stemcell 05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement Stemcell 05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium Stemcell 05041
Pronase E Sigma-Aldrich P5147
Rat tail collagen Corning 354236
Trypan Blue Stemcell 07050 

References

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Citer Cet Article
Zhang, M., Zhao, L., Li, K., Zhang, R., Lv, Z., Liu, J., Cui, Y., Wang, W., Ying, S. In Vitro Model for Studying Differentiation and Changes of Multi-Omics on Murine Airway Epithelial Cells Stimulated with Cigarette Smoke Extract. J. Vis. Exp. (209), e67057, doi:10.3791/67057 (2024).

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