完整 果蝇 幼虫中的激光细胞消融揭示了突触竞争
Summary
该协议展示了完整 果蝇 幼虫中单个神经元的激光细胞消融。该方法能够研究减少发育中的神经系统中神经元之间竞争的效果。
Abstract
该方案描述了在完整黑腹果蝇幼虫的中枢神经系统 （CNS） 中使用 2 光子激光系统进行单神经元消融。使用这种非侵入性方法，可以以细胞特异性方式操纵发育中的神经系统。破坏网络中单个神经元的发育可用于研究神经系统如何补偿突触输入的损失。在果蝇的巨纤维系统中，单个神经元被特异性消融，重点是两个神经元：突触前巨纤维 （GF） 和突触后尾转子运动神经元 （TTMn）。GF 与同侧 TTMn 突触，这对逃逸反应至关重要。在 GF 开始轴突生长后，消融第 3 龄大脑中的一个 GF，在 CNS 发育过程中永久去除细胞。剩余的 GF 与缺失的邻居发生反应，并与对侧 TTMn 形成异位突触末端。这种非典型的、双侧对称的末端支配两个 TTMns（如染料偶联所示），并驱动两个运动神经元（如电生理学测定所示）。总之，单个中间神经元的消融表明双侧神经元之间的突触竞争可以补偿一个神经元的损失并恢复对逃逸回路的正常反应。
Introduction
激光消融是解剖各种生物体神经回路的首选工具。它在蠕虫和苍蝇等模型遗传系统中开发，已应用于整个动物王国，以研究神经系统的结构、功能和发育 1,2,3。在这里，采用单神经元消融来研究神经元在果蝇回路组装过程中如何相互作用。果蝇的逃逸系统是最受欢迎的分析回路，因为它包含成年果蝇中最大的神经元和最大的突触，并且该回路在过去几十年中得到了很好的表征4。神经元-神经元相互作用在 Giant Fiber 电路的组装中的作用是本研究的重点。
自 1960 年代 Hubel 和 Wiesel 的工作以来，一种相互作用一直是神经科学的焦点，即“突触竞争”5,6。在该协议中，激光消融用于重新审视通过单细胞消融在果蝇巨纤维系统 （GFS） 中的竞争作用，在那里可能会发现该现象的分子基础。
由于各种原因，包括可视化目标神经元、消融方法的精度以及标本的存活率，对发育中的果蝇中的神经元进行消融一直很困难。为了克服 GFS 中的这些问题，使用 UAS/Gal4 系统7 标记感兴趣的神经元，并使用双光子显微镜去除突触前巨纤维或突触后跳跃运动神经元 （TTMn）。
在这项研究中，为了确定相邻的双侧神经元在调整 GFS 中的突触连接和突触强度中的作用，在蛹发育前删除了双侧神经元对之一（突触前 GF 或突触后运动神经元）。在这个发育阶段，GF 轴突发生尚未完成8。然后检查成人突触回路的 GF 结构和功能，特别注意剩余 GF 的输出。
Protocol
Representative Results
Discussion
事实证明，使用 2 光子显微镜进行细胞消融是操纵 果蝇神经元回路发育的一种非常成功的方法。由于这种方法是非侵入性的，因此对动物造成的伤害最小。数据支持这种对已知电路的单元特异性操作的有用性。
消融成功的关键是选择最合适的 Gal4 驱动程序。由于 GFS 得到了很好的研究，因此已经描述了许多特定的 Gal4 驱动程序系列7。大多数 Gal4 驱动?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在 FAU Stiles-Nicholson 脑研究所高级细胞成像核心中对 2 光子显微镜进行了实验。我们要感谢 Jupiter Life Science Initiative 的财政支持。
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
References
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92 (2014).
- Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
- Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. 47, e2412 (2011).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. 52, e3080 (2011).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
- Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), (2018).
- Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).
.