Tous les animaux utilisés pour le protocole étaient de l’espèce Drosophila melanogaster. Il n’y a aucun problème éthique entourant l’utilisation de cette espèce. Une autorisation éthique n’était pas nécessaire pour effectuer ce travail. Les détails de l’espèce, des réactifs et de l’équipement de la drosophile utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux. 1. Élevage de la drosophile et sélection du bon stade larvaire Choisissez une ligne pilote Gal4 qui pilote l’expression dans les cellules à ablater et recombinez-la avec une ligne rapporteuse UAS-GFP ou croisez-la vers une ligne rapporteuse UAS-GFP. Élevez les mouches avec de la nourriture anti-mouches standard à 25 °C.REMARQUE : Pour l’ablation par fibre géante (GF), R91H05-Gal4 ou A307-Gal4 a été recombiné avec UAS-GFP. ShakB(lethal)-GAL4 recombiné avec UAS-GFP a été utilisé pour les ablations TTMn (voir Tableau des matériaux). Sélectionnez les larves qui ont commencé à émerger de la nourriture et rampez sur le côté de la fiole de nourriture. Ces larves sont au stade errant, qui est le stade préféré pour effectuer l’ablation des cellules GF.REMARQUE : L’ablation peut être effectuée à n’importe quel stade larvaire. Le dernier stade larvaire était important pour la manipulation du développement du GFS car les corps des cellules GF peuvent être facilement identifiés dans le cerveau, mais les axones GF n’ont pas établi de connexions avec leurs cibles à ce stade. 2. Préparation de la larve du 3e stade REMARQUE : Les larves ont été anesthésiées à l’aide d’une méthode semblable à celle de Burra et al.9. Pour que les temps de procédure soient courts, ne préparez qu’une seule larve à la fois. Une courte exposition à un anesthésique améliorera la survie des animaux de laboratoire10. Préparez un plat en verre avec un couvercle hermétique. Placez une boule de coton dans le plat et, sous une hotte, ajoutez environ 3 à 5 ml d’éther éthylique (liquide dangereux et inflammable, blouse de laboratoire, gants, lunettes de protection). Couvrez le plat avec le couvercle. Prélever les larves individuelles du 3e stade dans les flacons de mouches. Au 3estade larvaire, les larves quittent le milieu alimentaire et rampent le long du côté du flaconalimentaire 11.Assurez-vous que les larves sont toujours en mouvement et n’ont pas commencé à former du puparium. Les larves qui sont stationnaires et qui présentent un raccourcissement du corps commencent la nymphose et ne conviennent pas à l’ablation. Ramassez les larves avec un petit pinceau.REMARQUE : Le 3èmestade larvaire commence après la deuxième mue à 72 h de développement (après la ponte), et dure jusqu’à la formation du puparium à 120 h pour les mouches élevées à 25 °C. Transférez une larve dans un petit récipient ouvert. Placez le récipient dans le plat en verre avec de l’éther éthylique et fermez bien le plat. Lorsque vous ouvrez le plat en verre, placez-le sous un tuba ou dans une hotte pour éviter que les fumées ne s’échappent.À intervalles de 30 s, retirez le couvercle avec la larve de la boîte et vérifiez la mobilité de la larve à l’aide d’un microscope de dissection. La larve sera généralement immobilisée en 1 min. Une fois que les crochets buccaux cessent de se contracter, la larve est prête à monter. Jetez toutes les larves qui ne sont pas complètement immobilisées après 3 min.REMARQUE : Le haut d’un couvercle renversé d’un tube de microcentrifugation (couvercle retiré du tube) peut être utilisé comme récipient. 3. Montage des larves sur des lames pour l’ablation Placez la larve anesthésiée sur une lame de microscope en verre. Immergez la larve dans une goutte de sérum physiologique pour insectes ; Cela emportera une partie des débris alimentaires qui pourraient coller à la larve. Sous le microscope de dissection, retirez la majeure partie de la solution saline à l’aide d’un mouchoir en papier. Positionnez la face dorsale de la larve vers le haut pour l’ablation GF ou la face ventrale vers le haut pour l’ablation TTMn. Abaissez lentement une lamelle en verre sur la larve. Ajoutez une solution saline sur le côté de la lamelle pour remplir l’espace entre la lame de verre et la lamelle. Pour l’ablation GF, vérifiez le positionnement du cerveau sous un fort grossissement sur le microscope de dissection. Assurez-vous que le cerveau est au niveau et qu’il est visible à travers la cuticule. Souvent, le cerveau est recouvert de tissu adipeux, ce qui rend la visualisation et l’ablation cellulaire impossibles.Pour déplacer tout tissu adipeux recouvrant le cerveau, appliquez une légère pression sur la lamelle à l’aide d’une pince et déplacez la lamelle d’un côté à l’autre. Si le tissu adipeux ne peut pas être éloigné du cerveau de cette façon, utilisez une autre larve à la place. 4. Localisation des cellules cibles REMARQUE : Le système multiphotonique utilisé pour cette étude a été monté sur un microscope vertical. Un logiciel spécifique au système a été utilisé pour contrôler les paramètres d’acquisition et de stimulation laser. Le système était équipé d’une source lumineuse à épifluorescence pour localiser les échantillons. L’objectif était un objectif à immersion dans l’eau avec un grossissement de 25x, une longue distance de travail de 2 mm et une NA de 1,10. Placez l’échantillon sur la platine du microscope multiphotonique et utilisez le filtre GFP pour localiser l’échantillon en mode épifluorescence. Pour l’ablation GF, les corps cellulaires peuvent être identifiés dans le cerveau, comme le montrent les figures 1A, C et D. Pour l’ablation TTMn, un groupe de quatre cellules peut être identifié du côté ventral dans le cordon nerveux ventral (VNC), comme le montre la figure 1A,B. Une fois la mise au point terminée, centrez les cellules dans le champ de vision et passez en mode 2 photons. 5. Configuration des paramètres d’ablation Ajustez les paramètres laser et le gain du détecteur pour visualiser les cellules exprimant la GFP avec le scanner Galvano. Une longueur d’onde de 870 nm fonctionne mieux pour visualiser le signal GFP. Centrez la cellule dans le champ de vision. Utilisez une zone d’intérêt circulaire pour définir la zone d’ablation. Assurez-vous que le retour d’intérêt couvre la majeure partie de la surface de la cellule (Figure 1E,G). Configurez le protocole d’ablation dans le logiciel. Définissez une image d’acquisition, puis une stimulation, suivie d’une autre image d’acquisition. Démarrez le réglage de la puissance du laser de stimulation à une valeur inférieure (10 %-20 %) et exécutez le protocole de stimulation. Une ablation réussie peut être reconnue par un cercle clair au centre du soma cellulaire à l’emplacement du ROI et une augmentation de la fluorescence autour du ROI (Figure 1F).Si l’ablation n’a pas réussi et n’a fait que blanchir la cellule (Figure 1H), augmentez la puissance du laser par incréments de 5 % ou le nombre de boucles une à la fois et exécutez à nouveau le protocole. La puissance laser appliquée était comprise entre 10 % et 40 % pour le système utilisé dans le protocole.REMARQUE : Les paramètres de puissance du laser pour l’ablation dépendent grandement de la profondeur à laquelle les cellules sont situées dans le tissu et d’autres facteurs tels que le pliage de la cuticule. Si les cellules sont brillantes et clairement visibles, la puissance laser se situera à l’extrémité inférieure de la plage. La puissance laser sera différente pour chaque système en fonction du modèle de laser et de l’âge du laser. Figure 1 : Identification des neurones pour l’ablation laser chez les larves intactes de Drosophila L3. (A) Schéma de l’emplacement du soma en fibre géante (GF) dans le cerveau et de l’amas de motoneurones contenant le motoneurone tergotrochantéral (TTMn) dans le cordon nerveux ventral (VNC). (B) Projection d’intensité maximale de l’expression motrice de la GFP par shakB(lethal)-Gal4 dans la VNC larvaire. La ligne médiane est indiquée par la ligne pointillée. Le cercle indique le groupe de neurones contenant le TTMn qui sont ciblés pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 50 μm. (C) Vue de projection partielle du cerveau larvaire exprimant la GFP sous le contrôle de A307-Gal4. Le cercle indique le soma GF ciblé pour l’ablation au laser. Barre d’échelle : 50 μm. (D) Projection d’intensité maximale du cerveau avec R91H05-Gal4 pilotant UAS-GFP. Les deux GF (cercles) sont identifiables par leur emplacement, leur forme et leur taille. Barre d’échelle : 50 μm. (E) Vue agrandie de GF soma avant ablation laser. Le cercle magenta indique la région cible pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 10 μm. (F) Vue agrandie de GF soma après administration de la puissance laser localisée et ablation réussie. Barre d’échelle : 10 μm. (G) Vue agrandie de la taille avant l’ablation laser. Le cercle magenta indique la région cible pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 10 μm. (H) Vue agrandie du soma GF après administration de la puissance laser localisée et ablation infructueuse (blanchiment). Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 6. Récupération des larves Après avoir réussi à ablater la cellule, retirez la lamelle et ramassez doucement les larves de la lame avec un pinceau. Placez les larves dans un flacon alimentaire. Les larves recommenceront à ramper dans les 30 minutes.REMARQUE : La réduction de la durée de la procédure améliore les taux de survie des animaux. Avec de l’expérience, l’expérience peut être réalisée en un peu moins de 10 minutes. Continuez à élever les larves dans des conditions normales jusqu’à ce qu’elles se ferment de l’enveloppe nymphale. 7. Test de la fonctionnalité du GFS chez les mouches adultes REMARQUE : Les étapes suivantes sont expliquées en détail dans Allan et Godenschwege12, et Augustin et al.13. Testez les mouches adultes à l’âge de 2 à 5 jours après l’éclosion. Anesthésisez les mouches avec du CO2 et montez-les sur de la cire dentaire en poussant les pattes dans la cire. Déployez les ailes à un angle de 90° et fixez-les en place avec la cire. Fixez la tête en enfonçant la trompe dans la cire. Placez des fils de stimulation dans les deux yeux, un fil de terre dans l’abdomen et des électrodes d’enregistrement en verre dans les muscles de saut (TTM) de chaque côté. Stimulez le circuit GF avec des stimuli uniques pour mesurer la latence de réponse des deux muscles. Stimulez le circuit avec des trains de stimuli de 100 Hz et 200 Hz, respectivement, pour mesurer la fréquence suivante pour les deux muscles. 8. Dissection et marquage du système de fibres géantes pour l’imagerie confocale REMARQUE : La dissection du SNC des mouches et l’injection de colorant sont détaillées dans Boerner et Godenschwege14. Retirez délicatement la mouche de la cire dentaire à l’aide d’une pince et transférez-la dans une boîte de Pétri doublée d’élastomère de silicone sous un endoscope de dissection. Retirez les pattes, les ailes et la trompe avec des ciseaux et utilisez des épingles à insectes pour fixer la face dorsale de la mouche vers le haut dans le revêtement en élastomère. Faites une incision latérale le long de la ligne médiane à partir du milieu de l’abdomen, à travers tout le thorax et le long du cou, en reliant le thorax à la tête. Ouvrez la mouche avec des épingles à insectes. Retirez les organes et les glandes de la mouche sans endommager le système nerveux.REMARQUE : À ce stade, les axones GF peuvent être injectés avec des colorants pour marquer les GF et les neurones couplés électriquement13. Retirez la capsule cérébrale de la tête pour exposer le cerveau. 9. Immunohistochimie du système nerveux Après dissection du SNC, fixer la mouche dans 4% de PFA dans du PBS pendant 45 min à température ambiante (RT). Laver pendant 20 min dans PBS à RT (3 fois). Bloquer l’échantillon pendant 1 h à RT dans 3% BSA dans PBS avec une solution détergente à 0,5%. Incuber pendant 2-3 nuits à 4 °C dans 3% BSA dans du PBS avec une solution détergente à 0,3% et anti-GFP pour lapin (1:500). Laver pendant 20 min en PBS à RT (6 fois). Incuber une nuit à 4 °C dans du PBS avec l’anti-lapin Alexa 488. Laver pendant 20 min en PBS à RT (6 fois). Déshydrater les échantillons avec une série ascendante d’éthanol (50 %, 70 %, 90 %, 100 % d’éthanol) pendant 10 min à chaque étape. Retirez les broches et coupez l’abdomen et les muscles de vol. Transférez le reste du thorax contenant le système nerveux sur une lame et couvrez-le d’un milieu de montage comme le salicylate de méthyle. Placez une lamelle sur l’échantillon et scellez-la avec du vernis à ongles. Imager le système nerveux au microscope confocal pour analyser l’anatomie de la terminaison GF.