Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers

Sai Nikhil Subraveti; Brian K. Wilson; Navid Bizmark; Jason Liu; Robert  K. Prud&#39;homme

doi:10.3791/67047

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bio-ingénierie

Синтез липидных наночастиц турбулентным потоком в струйных смесителях с ограниченным соударением

Published: August 23, 2024

doi:

10.3791/67047

Sai Nikhil Subraveti¹, Brian K. Wilson¹, Navid Bizmark¹, Jason Liu¹, Robert K. Prud’homme¹

¹Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University

Summary

Продемонстрирован подробный протокол синтеза липидных наночастиц (LNP) с использованием технологий смесителей с ограниченной струей (CIJ), включая двухструйный CIJ и четырехструйный многоструйный вихревой смеситель (μMIVM). Смесители CIJ создают воспроизводимые турбулентные микросмесительные среды, что приводит к производству монодисперсных LNP.

Abstract

Липидные наночастицы (ЛЧП) продемонстрировали свой огромный потенциал в качестве терапевтических средств доставки, о чем свидетельствует одобрение и глобальное использование двух вакцин на основе матричной РНК (мРНК) COVID-19. В небольших масштабах LNP часто изготавливаются с использованием микрофлюидики; Однако ограничения этих устройств исключают их использование в больших масштабах. Вакцины против COVID-19 производятся в больших количествах с использованием турбулентных смесителей с ограниченной ударной струей (CIJ). Технология CIJ позволяет производить продукцию в лабораторных масштабах с уверенностью в том, что она может быть масштабирована до производственных объемов. Ключевые концепции смешивания CIJ заключаются в том, что длина и временная шкала смешивания определяются интенсивностью турбулентности в полости смешивания, а образование наночастиц происходит вдали от стенок, что устраняет проблему осаждения на поверхностях и загрязнения. В данной работе демонстрируется процесс изготовления LNP с использованием технологии струйного смесителя с ограниченным соответствием и двух геометрий: двухструйного CIJ и четырехструйного многоструйного вихревого смесителя (MIVM). Обсуждаются преимущества и недостатки каждой геометрии смешивания. В этих геометриях LNP образуются путем быстрого смешивания потока органического растворителя (обычно этанола, содержащего ионизируемые липиды, со-липиды и стабилизирующие ПЭГ-липиды) с водным потоком антирастворителя (водный буфер, содержащий РНК или ДНК). Представлены рабочие параметры смесителей CIJ и MIVM для получения воспроизводимых LNP с контролируемым размером, дзета-потенциалом, стабильностью и эффективностью трансфекции. Также представлены различия между LNP, изготовленными с плохим смешиванием (пипетированием) по сравнению с смешиванием CIJ.

Introduction

Терапевтические препараты на основе мРНК обладают большим потенциалом для лечения и профилактики широкого спектра заболеваний, включая инфекционные заболевания, генетические нарушения и рак¹. В отличие от низкомолекулярных терапевтических средств, которые могут пассивно диффундировать через клеточную мембрану, нуклеиновые кислоты должны быть инкапсулированы для внутриклеточной доставки². Инкапсуляция обеспечивает структуру и стабильность мРНК, облегчая их внутриклеточную доставку по эндоцитарным путям, а также предотвращая деградацию внутри- и внеклеточных компонентов, таких как нуклеазы3^. Для инкапсуляции и доставки мРНК было разработано множество материалов и наноносителей, включая неорганические наночастицы, полимеры, липиды и липидоподобные материалы¹. Среди них LNP стали наиболее заметной платформой доставки терапевтических средств на основе мРНК⁴.

LNP состоят из четырех липидных компонентов: ионизируемого липида, холестерина, цвиттер-ионного липида и стабилизатора ПЭГ-липидов⁵. Ионизируемые липиды, пригодные для доставки мРНК, демонстрируют тщательный баланс между гидрофобностью липидов и константой диссоциации (pKa) тройной аминной группы⁶. Ионизируемый липид pKa обычно имеет pH от 6,0 до 6,7, например, KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) и ALC-0315⁷. Это ограничение pKa ионизируемого липида обеспечивает как инкапсуляцию полимеров нуклеиновых кислот в гидрофобные липидные соли, так и внутриклеточную доставку через процесс «ускользания эндосом». LNP проникают в клетку-мишень через (различные) пути эндоцитоза, которые включают подкисление эндосомы от pH 7,4 до pH ~5⁸. Ионизируемый липид pKa гарантирует, что LNP имеют почти нейтральную поверхность в физиологических условиях, но становятся катионными в подкисляющей эндосоме⁹. Этот рН-ответ позволяет избирательно разрушать только эндосомальную мембрану, высвобождать инкапсулированный полимер нуклеиновой кислоты и сохранять жизнеспособность клеток, в отличие от постоянно катионных липидов, используемых в трансфекционных системах, таких как липофектамин. Холестерин — это гидрофобная интерстициальная молекула в структуре LNP, которая улучшает текучесть липидов. Цвиттер-ионный липид играет структурную роль и образует бислой на поверхности LNP. Поли(этиленгликоль)-липид (ПЭГ-липид) является коллоидным стабилизатором, который повышает стабильность ЛНЧ за счет придания поверхности ЛНЧ полимерного стерического стабилизатора, который противостоит агрегации ЛНЧ. Это стабилизирует LNP, особенно во время изменений pH, которые регенерируют свободную форму ионизируемого липида, которая ведет себя как гидрофобное масло. Рецептура Onpattro (patisiran) (далее именуемая композицией LNP) часто используется в качестве отправной точки для разработки рецептуры LNP с ионизируемым липидом MC3, холестерином, дистеароилфосфатидилхолином (DSPC) и PEG2000-DMG, растворенными в этаноле, смешанном с водным раствором РНК¹⁰.

Для производства LNP, инкапсулирующих полимеры нуклеиновых кислот, можно использовать несколько методов, причем большинство из них основаны на общей теме быстрого смешивания потока этанола, содержащего липиды, с водным потоком, включающим представляющую интерес нуклеиновую кислоту (миРНК, мРНК или ДНК)^{9,11,12,13,14}. В связи с этим процессы смешивания сыпучих материалов, такие как смешивание с помощью пипеток и вихревое смешивание, предлагают простую стратегию формирования LNP, которая устраняет необходимость использования сложных приборов¹². Однако массовое смешивание не обеспечивает однородного распределения компонентов, что приводит к неоптимальному распределению LNP по размерам наряду со значительной вариабельностью от партии к партии¹⁵.

Лаборатории регулярно используют методы микрофлюидного смешивания для получения воспроизводимых LNP путем достижения более точного контроля над условиями смешивания 12,13,16. Тем не менее, условия ламинарного течения в микрофлюидных устройствах, которые присущи малой длине шкалы и низким скоростям в микрофлюидной камере, приводят к сравнительно медленному смешиванию растворителя и антирастворителя¹⁷. Небольшие размеры камеры серьезно ограничивают производительность и масштабируемость, необходимые для производства LNP по стандарту GMP, но исследователи распараллелили микрофлюидные камеры, чтобы попытаться масштабировать объемы производства^. Параллельная микрофлюидная геометрия не устраняет проблему адсорбции липидов к поверхностям при обработке больших объемов, проблему, обычно называемую «загрязнением» смесительного устройства, а также проблемы с однородностью и стабильностью потоков, которые затрудняют масштабирование микрофлюидики для промышленного производства^18,19. Неудивительно, что фармацевтические компании использовали турбулентные соударяющие струйные смесители для производства мРНК-ЛЧП против COVID-19²⁰.

Процесс производства ЛНК с нагрузкой на РНК включает в себя смешивание водного буферного потока, содержащего полезную нагрузку РНК, с потоком этанола, содержащим четыре различных липидных компонента. В этих составах используется кислотный буфер с pH 4,0 или ниже, который заряжает ионизируемый липид при смешивании водных и этанольных потоков. Положительно заряженные ионизируемые липиды электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженными РНК, образуя гидрофобную РНК-липидную соль. Гидрофобные липидные виды, в том числе РНК-липидная соль, выпадают в осадок в смешанных растворителях и образуют гидрофобные ядра. Эти ядра растут за счет осаждения цвиттер-ионных липидов и холестерина до тех пор, пока не достигнут критической точки, где достаточное количество пегилированных липидов адсорбируется на поверхности LNP, останавливая дальнейший рост-зарождение и механизм роста 21,22,23. Добавление водного буфера к липидному раствору в той степени, в которой липиды выпадают в осадок и образуются СНД, зависит от двух различных временных шкал: периода смешивания растворителя и антирастворителя,_{τ-смеси}, и периода роста ядер,_τ-agg. Безразмерное число Дамкёлера, определенное как Da = τ_mix/τ_agg, отражает взаимодействие между этими временными шкалами²⁴. В случаях медленного смешивания (Da > 1) конечный размер LNP контролируется транспортировкой и изменяется в зависимости от времени смешивания. И наоборот, при быстром перемешивании (Da < 1) жидкость фрагментируется на колмогровские бороздки или слои, при этом образование LNP регулируется исключительно молекулярной диффузией каждого компонента, что приводит к однородной кинетике образования LNP. Для достижения последнего сценария необходимо, чтобы концентрация липидов превышала критический порог, устанавливая состояние пересыщения, способствующее равномерному однородному зародышеобразованию.

Подсчитано, что τ_agg находится в диапазоне от нескольких десятков до нескольких сотен миллисекунд25. В своей самой простой конфигурации два потока, один из которых содержит этанол с липидами, а другой — водный буфер с грузом РНК, впрыскиваются в камеру, известную как смеситель с ограниченной струей столкновения (CIJ). Турбулентные вихри создают масштабы длины полосатости растворителя/антирастворителя в 1 мкм в течение 1,5 мс при работе с соответствующими скоростями. Скорости потоков и геометрия смешивания определяют преобразование линейного импульса в турбулентные вихри, которые смешивают потоки. Оно параметризуется безразмерным числом, числом Рейнольдса (Re), которое линейно пропорционально скоростям потока. Re вычисляется по формуле Re = Σ (V_iD_i/v_i), где V_i – скорость потока в каждом паре, v_i – кинематическая вязкость каждого потока, а D_i – диаметр входного отверстия потока в 2-струйных устройствах CIJ²⁶ или диаметр камеры в 4-струйных MIVM²⁷. Примечание: В некоторых ссылках для CIJ для определения Re²⁸ используется только один диаметр и скорость струи. Re находится в диапазоне от 1 до 100 в микрофлюидическом устройстве, тогда как в устройствах CIJ может быть достигнуто Re 125 000. В смесителе CIJ потоки с одинаковым импульсом сталкиваются, рассеивая свой импульс при ударе в виде турбулентного перемешивания, что приводит к эффективному микросмешиванию благодаря малым колмогоровским микромасштабам и малому числу Дамкёлера. Другим типом смесителя является «вихревой смеситель с несколькими входами» (MIVM), в котором четыре потока направляются в центральную камеру. В этой конфигурации непрерывные потоки в замкнутую смесительную камеру обеспечивают четко определенную временную шкалу смешивания. Все элементы жидкости проходят через зону высокоэнергетического смешивания в обоих типах смесителей. В отличие от них, простые смесительные устройства, такие как Т-образные соединения, не содержат камеры, которая обеспечивает зону смешивания, что приводит к меньшему смешиванию двух потоков из-за того, что импульс входящего потока в значительной степени отклоняется в направлении выхода, а не в виде турбулентного вихря. Смесители CIJ и MIVM могут работать в периодическом или непрерывном режимах, что обеспечивает гибкость для производства LNP в различных масштабах.

В этом протоколе описывается, как создаются оптимальные составы LNP с использованием двух технологий ограниченной струи: 2-струйной CIJ и 4-струйной смесители MIVM. Ранее была продемонстрирована работа смесителей CIJ и MIVM для получения НЧ с гидрофобными материалами ядра²⁹. К этой статье и видео следует обратиться в качестве дополнительного ресурса по образованию НЧ с помощью этих смесителей. В этом обновлении основное внимание уделяется образованию НЧ на основе липидов. Продемонстрирована возможность настройки размера LNP путем изменения условий микросмешивания. Кроме того, показана полезность технологий CIJ для получения стабильных, монодисперсных LNP с улучшенной эффективностью трансфекции in vitro в клетках HeLa по сравнению с LNP, полученными с использованием плохого смешивания пипеток. Кроме того, обсуждаются преимущества и недостатки каждой геометрии смешивания CIJ, а также соответствующие условия, необходимые для масштабирования этих смесителей.

Protocol

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов. 1. Приготовление буферов, потоков растворителей и антирастворителей Растворите все липидные компоненты в этаноле при заданных массовых концентрациях, как показано в таблице 1, чтобы получить патисиран LNP в составе10. Перед использованием нагрейте растворы до 37 °C с помощью мягкой ультразвука, чтобы повторно растворить выпавшие твердые частицы.ПРИМЕЧАНИЕ: Более крупные исходные растворы объемом в несколько миллилитров можно готовить и хранить при температуре 4 °C. Приготовьте ацетатный буферный исходный раствор в концентрации 100 мМ, pH 4, соединив 186 мг ацетата натрия и 464 мг уксусной кислоты в 80 мл воды, не содержащей нуклеаз. При необходимости отрегулируйте pH с помощью концентрированных HCl или NaOH и доведите окончательный объем до 100 мл. Приготовьте буферный стоковый раствор HEPES в концентрации 1 М, pH 7,5, растворив 23,82 г соли HEPES в 80 мл воды, не содержащей нуклеаз. При необходимости отрегулируйте pH с помощью концентрированных HCl или NaOH и доведите окончательный объем до 100 мл. Разбавьте интересующий полимер нуклеиновой кислоты и 100 мМ ацетатный буферный запас водой, не содержащей нуклеаз, с получением 300 мкг/мл раствора РНК в ацетатном буфере 30 мМ. Подготовьте достаточный объем рабочего раствора для запланированных экспериментов, и для этого протокола потребуется всего 1500 мкл для смесителей CIJ и MIVM.РНК, полученная от поставщика, уже будет находиться в соответствующем буфере, обычно в концентрации 10 мг/мл (дрожжевая РНК) или 1 мг/мл (мРНК, кодирующая люциферазу, LucRNA, или GFP-кодирующая мРНК, GFP-РНК). РНК дрожжей может быть использована в качестве недорогой модельной РНК для осадков. 2. Рецептура СНЧ с использованием двухструйного смесителя CIJ Подготовка и чистка оборудованияОчистите миксеры CIJ непосредственно перед использованием, промыв миксер этанолом. Наполните два шприца по 5 мл этанолом и зафиксируйте каждый во входном порту CIJ. Быстро нажмите на шприцы и соберите стоки миксера как отходы.ПРИМЕЧАНИЕ: Смесители CIJ могут быть сконструированы и эксплуатироваться так, как описано ранее29. Для удержания смесителя CIJ можно использовать различные опорные подставки, в том числе кольцевую подставку, держатель центрифужной пробирки или колбу Эрленмейера. Поставщики CIJ перечислены в Таблице материалов и Дополнительном файле 1. Извлеките шприцы для промывки этанола из CIJ. Эти шприцы можно хранить и повторно использовать для дополнительных промываний этанолом CIJ. Высушите внутренние каналы CIJ, продув сухую струю азота через входные адаптеры. Используйте только сухой, отфильтрованный воздух, который не загрязнен масляным туманом или аэрозолями, если азот недоступен. Приготовление потоков растворителей и антирастворителейСмешайте липидные исходные растворы и разбавьте дополнительным этанолом с получением 500 мкл липидного раствора 6 мг/мл, перечисленного в таблице 1 , в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта формула представляет собой широко используемую композицию Onpattro, содержащую 50 моль % MC3, 10 моль % DSPC, 38,5 моль % холестерина и 1,5 моль % DMG-PEG2000. Разбавьте 100 мМ ацетатного буферного запаса pH 4 до 10 мМ в общем объеме 4 мл в качестве ванны для тушения сточных вод смесителя CIJ.ПРИМЕЧАНИЕ: В закалочную ванну также можно добавить магнитную мешалку. Возьмите 500 мкл раствора РНК, приготовленного на шаге 1.4, в шприц объемом 1 мл. Переверните шприц и выдвиньте воздух из этого водного потока антирастворителя, содержащего полимер нуклеиновой кислоты. Извлечь 500 мкл липидного раствора, приготовленного на шаге 2.2.1, в шприц объемом 1 мл. Переверните шприц и выпустите воздух из этого потока этанолового растворителя, содержащего липиды. Производство LNP в смесителе CIJПоместите чистый миксер CIJ над флаконом для закалочной ванны.ПРИМЕЧАНИЕ: Кольцевой зажим для подставки или штатив для труб является удобной опорой для миксера CIJ. На рисунке 1A показана типичная конфигурация CIJ. Соедините два шприца, заполненных на шаге 2.2.3 и шаге 2.2.4, с входными портами смесителя CIJ. Быстро нажмите на оба шприца, чтобы смешать потоки растворителя и антирастворителя и собрать липидные NP в охлаждающей ванне.ПРИМЕЧАНИЕ: шприцы должны быть введены быстро (менее чем за 1 с), но плавно и равномерно. Асимметричный или медленный поток приведет к образованию полидисперсных больших LNP. Снимите миксер CIJ с ванны для гашения с прикрепленными шприцами.ПРИМЕЧАНИЕ: Не извлекайте шприцы и не позволяйте объему удержания стекать в закалочную ванну, так как этот материал плохо перемешивается и отрицательно повлияет на дисперсионные свойства производства при смешивании с закалочной ванной. Держите CIJ над контейнером для отходов и извлеките шприцы, позволяя остаточному объему задерживаться в контейнере для отходов. Утилизируйте эти шприцы и повторите процесс очистки, как описано в разделе 2.1. Проанализируйте LNP, созданные с помощью CIJ, как описано в разделе 5 ниже. 3. Рецептура СНЧ с использованием четырехструйного смесителя MIVM Сборка микшера MIVM, называемого микроразмерным MIVM (μMIVM), чтобы отличать его от более крупных моделей, используемых для масштабного производстваСоберите все отдельные компоненты, необходимые для сборки микшера MIVM: нижний ресивер, диск с геометрией смешивания, верхний диск, уплотнительное кольцо и гаечный ключ.ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция, сборка и эксплуатация MIVM ранее были продемонстрированы для инкапсуляции гидрофобных веществ, а поставщики перечислены в Дополнительном файле 1 и Таблице материалов29. На рисунке 2 приведена схема компонентов и терминология стойки для смесителя. Установите уплотнительное кольцо в канавку в смесительном диске. Совместите отверстия для смесительного диска с колышками на верхнем диске и сдвиньте их вместе, не смещая уплотнительное кольцо. Свободно прикрутите сопряженный смесительный диск, уплотнительное кольцо и узел верхнего диска к нижнему ресиверу.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим шагом снимите выпускную трубку с нижнего ресивера. Затяните верхний диск в нижнем ресивере с помощью гаечного ключа.ПРИМЕЧАНИЕ: Пищевой или фармацевтический противозадирный состав может быть нанесен на верхнюю резьбу диска, если наблюдается истирание нити. Вставьте и затяните фитинг выпускной трубки в нижний ресивер, чтобы завершить MIVM. Установите собранный MIVM на стойку смесителя так, чтобы выпускная трубка выходила через опорную пластину.ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуру регулировки стойки микшера MIVM следует периодически выполнять, чтобы убедиться в правильной настройке механических упоров на стойке микшера29. Приготовление потоков растворителей и антирастворителейСмешайте два раствора потока этанольных липидных растворителей в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, как указано в таблице 2, разбавляя исходные растворы липидов и добавляя дополнительный этанол по мере необходимости для достижения конечной концентрации липидов 6 мг/мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Это тот же состав липидного раствора, что и в 2.2.1, но с общим объемом 1000 мкл. Разбавьте 100 мМ ацетатного буферного запаса pH 4 до 10 мМ в общем объеме 8 мл в качестве ванны для тушения сточных вод MIVM.ПРИМЕЧАНИЕ: В закалочную ванну также можно добавить магнитную мешалку. Рецептура LNP с помощью смесителя MIVMПоместите закалочную ванну объемом 8 мл под подставку смесителя так, чтобы отводящая трубка сливалась в закалочную ванну. Наберите струи растворителя и антирастворителя в газонепроницаемые шприцы объемом 1 мл с помощью иглы с тупым концом. Удалите все пузырьки воздуха и утилизируйте иглу. Подготовьте каждый шприц, перевернув и выдавив воздух из шприца. Установите четыре шприца на миксер по часовой стрелке (шприцы 1-4, таблица 2) теми же струями на противоположных сторонах. На рисунке 1B приведена окончательная схема внешнего вида. Удерживайте корпус подшипника с обеих сторон подвижной пластины. Не располагайте пальцы на нижней поверхности корпуса, так как это создает опасность защемления из-за механических упоров. Осторожно опустите подвижную пластину до тех пор, пока она равномерно не упрется в шприцы.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы все поршни шприца должны находиться на одинаковой высоте. Неуклонно и плавно нажимайте на пластину, стремясь завершить операцию примерно за 0,5 с до 1 с для этих объемов потока. Закупорьте закалочную ванну, в которой содержится дисперсия LNP. Выполните очистку MIVM после использования, следуя инструкциям в шаге 3.5 ниже. Рецептура LNP с помощью смесителя MIVM, приводимого в действие шприцевым насосомСоберите MIVM, как описано в шаге 3.1. Приготовьте растворы растворителей и антирастворителей в нужном составе и в достаточном объеме для требуемого размера рецептуры (табл. 3).Примечание: Это те же составы, что и потоки водного антирастворителя (шаг 1.4) и этанолевого растворителя (этап 3.2.1), но они масштабированы для использования с большими объемами шприцев, указанными в таблице 3. Загрузите растворы в газонепроницаемые шприцы объемом 20 мл и прикрепите трубки из ПТФЭ с помощью адаптера Люэра, установленного на конце. Подготовьте шприцы и трубки, перевернув шприц и трубку, а затем выпустив воздух. Установите шприцы в шприцевой насос и прикрепите шприцы к входным отверстиям смесителя на MIVM, как показано на рисунке 3A.ПРИМЕЧАНИЕ: CIJ также может работать с помощью насосов таким же образом, но только с одним шприцем с антирастворителем и струей растворителя. Разбавьте 100 мМ ацетатного буферного запаса pH 4 до 10 мМ в общем объеме 320 мл в качестве ванны для гашения сточных вод MIVM. Поместите ванну для закалки под выпускное отверстие MIVM. Установите объемный расход на шприцевом насосе на 20 мл/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Объемный расход можно изменять в диапазоне от 2 мл/мин до 40 мл/мин путем ручной установки значений на шприцевом насосе для формирования LNP с различными условиями микросмешивания. Запустите шприцевой насос, но дайте первым 10 секундам стока стечь в стакан для отходов. Соберите стоки MIVM в закалочной ванне после этого 10-секундного пускового периода. Снимите и закупорьте закалочную ванну, содержащую дисперсию LNP, сделанную при выбранной (20 мл/мин) объемной скорости потока.ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру можно повторить для синтеза LNP с различными скоростями потока путем выбора соответствующих объемов закалочной ванны. Очищайте MIVM между каждым экспериментом (при изменении скорости потока) путем промывки не менее чем в два раза объема выходных трубок, чтобы предотвратить сбор СНД, полученных при предыдущем условии расхода, перед началом следующего синтеза СНЧ. Чистка оборудования после использованияОтсоедините миксер от подставки, удерживая шприцы прикрепленными, и держите его над контейнером для отходов. Извлеките шприцы, дав задержному объему стечь в контейнер. Затем держите смеситель в сборе вверх дном и с помощью гаечного ключа разберите миксер. Промойте выпускную трубку растворителем (например, этанолом) и высушите воздухом или азотом. Промойте геометрию смешивания подходящим растворителем, таким как деионизированная вода или этанол, а затем промойте этанолом. Высушите компоненты с помощью потока воздуха или азота. Промойте уплотнительное кольцо деионизированной водой и промокните насухо.ПРИМЕЧАНИЕ: Если уплотнительное кольцо выглядит растянутым или деформированным, дайте ему высохнуть на воздухе в течение ночи перед использованием. Поддерживайте большой запас уплотнительных колец, так как они являются расходными материалами. Если форма не восстанавливается к следующему дню, утилизируйте уплотнительное кольцо. Тщательно промойте верхний диск растворителем, используя струю воздуха или азота, чтобы высушить поверхность и фитинги шприца. Промойте каждый шприц хорошим растворителем (например, деионизированной водой или этанолом). Нанесите заключительное полоскание этанолом и высушите на воздухе перед следующим использованием. 4. Постобработка LNP Буферный обмен и удаление этанолаДиализуйте дисперсию LNP на 10 мМ буфере HEPES при pH 7,4 с использованием диализной кассеты соответствующего размера с картриджем для отсечения молекулярной массы 20 кДа.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляется остаточный 10% этанол и увеличивается pH дисперсии за счет замены ацетатного буфера на HEPES. Развести в запасе 1 М HEPES буфер до 10 мМ в общем объеме 1 л. Загрузите дисперсию LNP в диализную кассету объемом 12 мл с помощью шприца и иглы. Погрузите диализный картридж в 1 л буфера HEPES и магнитом перемешайте внешний буфер. Замените внешний буфер HEPES через 3 часа и извлеките картридж для диализа еще через 3 часа, общее время диализа составит 6 часов. Извлеките диализованную дисперсию LNP из диализного картриджа и выбросьте стреляный картридж. Концентрирование суспензии LNP с помощью ультрацентрифугированияДозируйте суспензию в центробежный фильтр соответствующего размера с MWCO со скоростью 100 кДа30.ПРИМЕЧАНИЕ: Центробежные фильтры доступны в различных размерах, обычно от 0,5 мл до 12 мл. Центрифугируйте дисперсию при 2000 x g в течение 10-20 минут (при комнатной температуре) для увеличения концентрации примерно в 5-20 раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время центрифугирования проверяйте образец каждые 5 минут, чтобы убедиться, что осталось соответствующее количество жидкости. 5. Характеристика LNP Гидродинамические измерения диаметров с помощью динамического рассеяния света (DLS)Диспонируйте 750 мкл или 900 мкл приготовленной дисперсии LNP (без каких-либо разбавлений) в пластиковую микро- или квадратную кювету соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие объемы также могут быть использованы в соответствующих кюветах. Установите соответствующую вязкость для растворителя, в котором диспергируются LNP (т.е. 1,26 сП для смеси этанола 10 об.%). Соберите обратно рассеянный свет под углом 173° при 25 °C, а затем определите размер LNP с помощью модели Стокса-Эйнштейна и первого кумулятива разложения ряда корреляционной функции рассеяния света, как определено в стандартном документе ISO 13321:1996 E. Повторите измерения не менее трех раз. Измерения дзета-потенциалаДобавьте ~800 мкл готовой дисперсии LNP в свернутые капиллярные дзета-сайзерные ячейки.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать захвата пузырьков в капиллярном канале, половина жидкости дозируется в клетки, удерживается вверх ногами, а затем вращается. Повторите измерения не менее трех раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов проводимость буфера должна составлять от 0,2 до 2 миллиСименс/см. Измерение эффективности инкапсуляции (ЭЭ) с помощью коммерчески доступного набора для количественного определения РНКРазбавьте соответствующее количество 20-кратного буфера Tris-EDTA (TE) при pH 7,5, указанном в наборе для анализа, до 1-кратной концентрации, используя воду, не содержащую нуклеаз. Приготовьте раствор Triton X-100 в концентрации 2 мас.%. Разбавьте соответствующее количество дисперсий LNP в буфере 1x TE до получения общей массовой концентрации примерно 0,6 мкг/мл для РНК с содержанием этанола менее 0,2 об%. Получить образцы, аналогичные тем, что и на предыдущем этапе, но содержащие 0,5 мас.% Triton X-100, который эффективно растворяет LNP, облегчая дифференциацию между «свободной» и общей концентрациями РНК в отсутствие и в присутствии Triton X-100 соответственно. Приготовьте соответствующие количества растворов контрольной РНК в концентрациях 0 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 0,8 мкг/мл и 1,0 мкг/мл в 1х TE буфере.ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально может потребоваться разбавление набора РНК. Повторите предыдущий шаг, но при 0,5 мас.% Triton X-100. Разведите краситель Рибогрин (входит в комплект) в 200 раз в 1х TE буфере. Добавьте соответствующие объемы разбавленного красителя Рибогрин ко всем приготовленным контрольным РНК и растворам образцов, как с Triton X-100, так и без него. Краситель должен быть равномерно разбавлен как по контрольной РНК, так и по растворам образца в два раза. Следовательно, общее разбавление красителя в 400 раз превышает его исходную концентрацию в наборе для анализа. Вихревой перемешиваем емкости. Подготовьте 96-луночную, необработанную, плоскодонную, непрозрачную пластину для анализа в считывателе планшетов. Диспенсируйте 100 мкл образцов и контроля РНК в отдельные ячейки планшета.ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за образованием пузырьков в растворах, содержащих Triton X-100. Для каждого образца проводится не менее трех повторений, для чего требуется не менее 350 мкл образцов. Регистрация интенсивности флуоресценции с помощью считывателя пластин на длине волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 528 нм с продолжительностью освещения примерно 10 с на одно показание. Не нужно встряхивать.ПРИМЕЧАНИЕ: EE определяется по формуле , где Iс Triton и Iбез Triton представляют усредненную интенсивность флуоресценции трех повторений образцов с Triton X-100 и без него, соответственно, а aс Triton и aбез Triton обозначают наклон линейных подгонок к двум усредненным калибровочным кривым с Triton X-100 и без Triton X-100, соответственно31.

Representative Results

Скрининг оптимальных составов LNP может быть быстро достигнут с относительно небольшими количествами материала с использованием двухпоточных турбулентных смесителей CIJ, при условии, что они работают с соответствующими скоростями. Смеситель μMIVM, приводимый в действие программируемым шприцевым насосом, как показано на рисунке 3A, используется для того, чтобы подчеркнуть важность достижения достаточного микросмешивания, превышающего критическое число Рейнольдса, для формирования небольших монодисперсных LNP. Таблица 3 содержит сводку составов, используемых для производства LNP, а настройка смесителя соответствует протоколу, описанному в шаге 3.4. Размеры LNP характеризовались динамическим рассеянием света (DLS) в зависимости от числа Рейнольдса. Как показано на рисунке 3B, за пределами критического Re 5000 наблюдаются малые и монодисперсные LNP. Более того, высокие числа Рейнольдса (~104-10 5) могут быть доступны при равномерном нажатии на шприцы при ручном управлении или с помощью смесительной стойки (крайняя правая точка данных на рисунке 3B). Смесительный стенд, показанный на фиг.2А, равномерно нажимает все шприцы одновременно27. Как следствие, такие LNP также имеют оптимальные размеры. При недостаточном перемешивании (т.е. слишком малом Re) образуются более крупные LNP. Фотографии, репрезентативные для СНЧ, сформированных при низком (фото 1) и высоком Re (фото 2), представлены на рисунке 3В. Образцы, полученные при низком Ре, мутные, что указывает на наличие больших коллоидных светорассеивающих структур (эффект Тиндалля), но LNP, образованные при высоком Ре, кажутся прозрачными из-за более слабого синего смещения рассеяния от более мелких коллоидов. Ионизируемые липиды обладают различными физико-химическими свойствами, которые влияют на физико-химические свойства LNP, произведенных с использованием идентичных в остальном липидных составов. Для проверки этого используется смеситель CIJ (рис. 1A). В таблице 4 перечислены составы, изготовленные с использованием двух одобренных FDA ионизируемых липидов: ALC-0315 и MC3. На рисунке 4A показано, что LNP, изготовленные с pH 5 из ALC-0315, имеют ~80 нм, тогда как LNP, изготовленные с использованием MC3, имеют ~60 нм. Более того, при pH 5 MC3-LNP имеют положительный дзета-потенциал (~28 мВ), в то время как ALC-LNP имеют нейтральный дзета-потенциал (<10 мВ). Это различие в поверхностном заряде, а также в общем размере СНЧ возникает из-за pKa двух липидов. MC3 имеет более высокий pKa (6,44) по сравнению с ALC0315 (6,09)32; следовательно, более высокая фракция липидов MC3 заряжается при pH 5. Оба препарата содержат стабилизатор ПЭГ-липидов с содержанием 1,5 мол.; однако MC3-LNP стабилизируются при меньшем размере из-за больших электростатических отталкиваний во время сборки LNP во время агрегации, ограниченной диффузией, что останавливает рост при меньшем размере. Обе рецептуры демонстрируют высокую эффективность инкапсуляции (>90%), как показано на рисунке 4B. Химический состав липидов имеет решающее значение для определения общих свойств, а также производительности LNP, поэтому их необходимо тщательно выбирать в зависимости от целевого применения. СНЧ, изготовленные с использованием обеих геометрий турбулентного смесителя (шаг 2.3 и шаг 3.3), имеют схожие физико-химические свойства. Это сравнение также распространяется на LNP, изготовленные в результате неэффективных методов смешивания, таких как смешивание с помощью пипеток, чтобы еще больше проиллюстрировать различие между турбулентными смесителями и неравномерными методами смешивания (Рисунок 1C). В таблице 5 приведена краткая информация о рецептурах, используемых для изготовления LNP, как показано на рисунке 5. В случае смешивания с помощью пипетки равные объемы этанола и водных потоков быстро перемешиваются путем пипетирования вверх и вниз в течение 15-20 с, после чего смесь пипетируется в ацетатную буферную ванну при pH 4. На рисунке 5A показано, что размеры LNP в ацетатной буферной ванне с температурой 10 мМ (pH 4, 10 об.% этанола) поразительно схожи и малы (~50 нм) независимо от используемой геометрии смесителя (CIJ или MIVM). Тем не менее, LNP, изготовленные с помощью смешивания с помощью пипетки, в два раза больше LNP, изготовленных с использованием турбулентных миксеров. Это показывает, что LNP, изготовленные из разных геометрий CIJ, проявляют схожие свойства при изготовлении на достаточно высоких скоростях (турбулентный режим выше критического числа Рейнольдса), в то время как плохое смешивание приводит к более крупным полидисперсным LNP. Затем LNP диализуются с использованием буфера HEPES с концентрацией 10 мМ, pH 7,4 (в 100 раз больше объема), чтобы удалить этанол и переключить pH на 7,4. Во время этого процесса происходит некоторое слияние LNP и рост до несколько большего размера, как показано на рисунке 5A, что соответствует хорошо изученному механизму слияния в литературе33. В целом, LNP, изготовленные с использованием смесителей CIJ и MIVM, имеют длину менее 100 нм, в то время как LNP, изготовленные с помощью смешивания пипеток, имеют длину волны около 140 нм. Как показано на рисунке 5B, дзета-потенциалы для этих составов составляют менее 10 мВ, что указывает на то, что все они нейтральны при pH 7,4. Кроме того, все они демонстрируют высокую эффективность инкапсуляции на уровне >95% (Рисунок 5C). Таким образом, ЛЭП с оптимальными физико-химическими свойствами могут быть легко изготовлены с использованием турбулентных технологий перемешивания. Эффективность этих LNP оценивается путем проведения трансфекции in vitro в клетки HeLa. Протокол трансфекционного анализа in vitro на основе люциферазы взят из предыдущей публикации34. На рисунке 6А представлен график люминесценции (RLU) на 1000 клеток для трех составов, обобщенных в таблице 5. Липофектамин 3000 используется в качестве положительного контроля. Важно отметить, что липофектамин 3000 обычно используется для составов ДНК; Тем не менее, он работал как адекватный контроль в этих экспериментах. LNP, изготовленные с использованием 2-струйных и 4-струйных микшеров MIVM, трансфектируют намного лучше, чем LNP, изготовленные с помощью смешивания пипеток. Несмотря на то, что ожидается, что более крупные частицы будут преобразовываться лучше, чем мелкие, из-за большей полезной нагрузки на ЧНП, СНП, изготовленные с использованием смешивания пипеток, преобразуют менее эффективно. Из этого явно следует, что существует значительная разница в структуре LNP, изготовленных с использованием технологий CIJ, по сравнению с LNP, изготовленными с помощью смешивания пипеток. Эффективность трансфекции LNP, изготовленных с помощью смесителей CIJ и MIVM, в основном идентична. Липофектамин 3000 показывает самую низкую эффективность трансфекции. На рисунке 6B оценена токсичность LNP in vitro на клетках HeLa с использованием анализа жизнеспособности клеток на основе соли резазуринанатрия 35. Все составы демонстрируют низкую цитотоксичность, проявляющуюся в высоком уровне жизнеспособности клеток при построении графика в процентном отношении к живым клеткам по сравнению с контролем, который не подвергается обработке наночастицами. Рисунок 1: Методы смешивания для получения LNP. (A) Двухструйный струйный смеситель с ограниченным соударением (CIJ), показывающий фотографию прозрачного смесителя и собранной смесительной установки Delrin, регулярно используемой в лаборатории. (B) Четырехструйный микро-многоканальный вихревой смеситель (μMIVM), показывающий фотографию прозрачного смесителя и собранной смесителя из нержавеющей стали и смесителя Delrin. Входные потоки для прозрачного смесителя были перемещены по бокам смесителя для лучшей визуализации геометрии смешивания, в то время как в практичном смесителе входные потоки поступают сверху. Как CIJ, так и μMIVM работают с достаточной скоростью жидкости, чтобы потоки находились в турбулентном режиме, а при смешивании образуются колмогоровские микромасштабы размером менее 1 мкм, что позволяет достичь пересыщения за ~1,5 мс. (C) Установка для смешивания пипеток широко используется для получения небольших объемов дисперсий LNP путем смешивания водных и этанольных растворов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2: Расширенный вид μMIVM и его смесительной стойки .(A) Собранный μMIVM, со стеклянными шприцами, под стойкой для смесителя, что способствует равномерному и быстрому опусканию шприцев. Этот рисунок воспроизведен из Markwalter et al.29. (B) Разобранный μMIVM с указанием внутренних компонентов. Эта геометрия смешивания идентична прозрачному смесителю на рисунке 1B, за исключением того, что входные потоки поступают через верхний диск, а не через боковую цилиндрическую поверхность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3: Увеличение числа Рейнольдса в турбулентном смесителе уменьшает гидродинамический диаметр LNP до критического числа Рейнольдса. (A) Схематическое изображение шприцевого насоса и настройки μMIVM, используемой для управления числом Рейнольдса в турбулентном смесителе путем установки объемных скоростей потока. (B) Гидродинамический диаметр LNP в сравнении с числом Рейнольдса в MIVM. Увеличение числа Рейнольдса и турбулентная диссипация энергии улучшают перемешивание и приводят к более однородному перемешиванию, пересыщению и росту частиц. Выше критического числа Рейнольдса размеры LNP остаются постоянными с увеличением скорости потока из-за условия Da<<1, т.е. время диффузии растворителя/антирастворителя короче, чем время сборки NP. Приведенные скорости потока представляют собой общие скорости потока всех четырех потоков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 4: Коллоидные свойства LNP, полученных с различными ионизируемыми липидами. (A) Гидродинамические диаметры и дзета-потенциалы LNP, полученных с использованием двух различных ионизируемых липидов: ALC-0315 и MC3. Измерения проводятся при pH 5 в закалочной ванне после образования LNP. Различия в видимом pKa ионизируемых липидов влияют на коллоидные свойства LNP. (B) Измерения эффективности инкапсуляции обоих LNP (n = 3, погрешность представляет одно стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 5: Коллоидные свойства LNP, полученных с помощью различных смесителей, инкапсулирующих мРНК люциферазы с использованием ионизируемого липида MC3. (A) Гидродинамические диаметры LNP, полученных с помощью 2-струйных, 4-струйных и пипетных смесителей. Измерения проводятся как в кислых условиях закалочной ванны после образования ЛНЧ (слева), так и после диализа в нейтральный буфер HEPES (справа). Размер LNP увеличивается во время нейтрализации pH из-за деионизации ионизируемого липида, что приводит к слиянию и росту LNP. Липидный стабилизатор ПЭГ останавливает рост этой коалесценции частиц до образования осадков микронного размера. (B) Измерения поверхностного заряда (в качестве ζ-потенциала) на диализованных LNP в состоянии 10 мМ HEPES, pH 7,4. Все СНП находятся в пределах 2 мВ от 0 мВ, что указывает на то, что эти поверхности частиц нейтральны и имеют почти неопределяемое количество катионного заряда. (C) Измерения эффективности инкапсуляции после диализа LNP (n = 3, погрешности представляют одно стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 6: Трансфекция клеток HeLa с помощью подготовленных LNP. (А) Люминесценция экспрессированного фермента люциферазы после лечения люциферином. (B) Жизнеспособность клеток HeLa после инкубации с LNP. Клетки не демонстрируют статистически значимых изменений жизнеспособности, на что указывает метаболический анализ резазурина (n = 4, погрешность представляет собой одно стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Поток(и) /Закалочная ванна Компонент Формулировка Запас Том Шприц 1 -Поток этанола(6 мг/мл общего липида) Ионизируемый липид (MC3) 50 моль % 50 мг/мл 0,5 мл Цвиттерион липид (DSPC) 10 моль % 5 мг/мл Холестерин 38,5 моль % 5 мг/мл Пегилированный липид (DMG-PEG2000) 1,5 моль % 4 мг/мл Шприц 2 -Водный поток(0,3 мг/мл РНК) РНК дрожжей Н/6 10 мг/мл 0,5 мл Ацетатный буфер 20 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 Закалочная ванна Ацетатный буфер 10 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 4 мл Таблица 1: Стандартная рецептура патисиран LNP, полученная с помощью смесителя CIJ. Дрожжевая РНК используется в качестве модельной РНК для этого протокола. Все растворы молекулярно растворяют и тщательно перемешивают перед загрузкой их в шприцы. Поток(и) /Закалочная ванна Компонент Формулировка Запас Том Шприц 1 -Поток этанола(6 мг/мл общего липида) Ионизируемый липид (MC3) 50 моль % 50 мг/мл 0,5 мл Цвиттерион липид (DSPC) 10 моль % 5 мг/мл Холестерин 38,5 моль % 5 мг/мл Пегилированный липид (DMG-PEG2000) 1,5 моль % 4 мг/мл Шприц 2 -Водный поток(0,3 мг/мл РНК) РНК дрожжей Н/6 10 мг/мл 0,5 мл Ацетатный буфер 20 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 Шприц 3 -Поток этанола(6 мг/мл общего липида) Ионизируемый липид (MC3) 50 моль % 50 мг/мл 0,5 мл Цвиттерион липид (DSPC) 10 моль % 5 мг/мл Холестерин 38,5 моль % 5 мг/мл Пегилированный липид (DMG-PEG2000) 1,5 моль % 4 мг/мл Шприц 4 -Водный поток(0,3 мг/мл РНК) РНК дрожжей Н/6 10 мг/мл 0,5 мл Ацетатный буфер 20 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 Закалочная ванна Ацетатный буфер 10 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 8 мл Таблица 2: Стандартная рецептура патисиран LNP, полученная с помощью смесителя MIVM. Смеситель MIVM использует четыре потока – два растворителя и два антирастворителя. Могут использоваться потоки с неравными импульсами; Однако для этого протокола выбираются потоки с равными импульсами. Поток(и) /Закалочная ванна Компонент Формулировка Запас Том Шприц 1 -Поток этанола(6 мг/мл общего липида) Ионизируемый липид (MC3) 50 моль % 50 мг/мл 20 мл Цвиттерион липид (DSPC) 10 моль % 5 мг/мл Холестерин 38,5 моль % 5 мг/мл Пегилированный липид (DMG-PEG2000) 1,5 моль % 4 мг/мл Шприц 2 -Водный поток(0,3 мг/мл РНК) РНК дрожжей Н/6 10 мг/мл 20 мл Ацетатный буфер 20 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 Шприц 3 -Поток этанола(6 мг/мл общего липида) Ионизируемый липид (MC3) 50 моль % 50 мг/мл 20 мл Цвиттерион липид (DSPC) 10 моль % 5 мг/мл Холестерин 38,5 моль % 5 мг/мл Пегилированный липид (DMG-PEG2000) 1,5 моль % 4 мг/мл Шприц 4 -Водный поток(0,3 мг/мл РНК) РНК дрожжей Н/6 10 мг/мл 20 мл Ацетатный буфер 20 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 Закалочная ванна(Время сбора= 30 с) Буфер HEPES 10 мМ, pH 7,5 1 м, pH 7,5 320 мл Таблица 3: Рецептура LNP, полученная с помощью смесителя MIVM, приводимого в действие шприцевым насосом. DODMA используется в качестве ионизируемого липида вместе с дрожжевой РНК в качестве модельной РНК. Для этого протокола выбран пример прогона со скоростью 40 мл/мин. Поток(и) /Закалочная ванна Компонент Формулировка Запас Том Шприц 1 -Поток этанола(12 мг/мл общего липида) Ионизируемый липид (MC3 или ALC0315) 50 моль % 50 мг/мл 0,5 мл Цвиттерион липид (DSPC) 10 моль % 5 мг/мл Холестерин 38,5 моль % 5 мг/мл Пегилированный липид (DMG-PEG2000) 1,5 моль % 4 мг/мл Шприц 2 -Водный поток(0,6 мг/мл РНК) РНК дрожжей Н/6 10 мг/мл 0,5 мл Ацетатный буфер 20 мМ, pH 5 100 мМ, pH 5 Закалочная ванна Ацетатный буфер 10 мМ, pH 5 100 мМ, pH 5 9 мл Таблица 4: Составы LNP из двух различных ионизируемых липидов, полученных с помощью смесителя CIJ. Рецептуры изготавливаются либо из ALC-0315, либо из MC3, в то время как все остальные компоненты остаются прежними. Поток(и) /Закалочная ванна Компонент Формулировка Запас Том Шприц 1 -Поток этанола(6 мг/мл общего липида) Ионизируемый липид (MC3) 50 моль % 50 мг/мл 0,5 мл Цвиттерион липид (DSPC) 10 моль % 5 мг/мл Холестерин 38,5 моль % 5 мг/мл Пегилированный липид (DMG-PEG2000) 1,5 моль % 4 мг/мл Шприц 2 -Водный поток(0,3 мг/мл РНК) FLuc мРНК Н/6 1 мг/мл 0,5 мл Ацетатный буфер 20 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 Закалочная ванна Ацетатный буфер 10 мМ, pH 4 100 мМ, pH 4 4 мл Таблица 5: Стандартная рецептура патисиран LNP, полученная с помощью смесителя CIJ. МРНК FLuc, экспрессирующая белок люциферазы, используется для измерения экспрессии генов с помощью биолюминесцентного анализа. Дополнительный файл 1: Поставщики микшеров CIJ и MIVM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Представлен синтез СНЧ, содержащих полимеры нуклеиновых кислот, с использованием двух турбулентных смесителей с ограниченной струей. При проведении с соответствующими скоростями турбулентные смесители CIJ обеспечивают более короткую временную шкалу смешивания, чем время сборки LNP, создавая однородные условия пересыщения для формирования небольших LNP с узкими распределениями по размерам²¹. Следовательно, LNP, изготовленные с использованием одного и того же химического состава с использованием различных геометрий турбулентных смесителей (2-струйный смеситель CIJ и 4-струйный смеситель MIVM), демонстрируют схожие физико-химические свойства и хорошую эффективность трансфекции (рис. 5 и рис. 6). Напротив, СНЧ, изготовленные с использованием пипетирования, которое обеспечивает более низкое смешивание, приводят к более крупным и полидисперсным СНП (Рисунок 5А) с более низкой эффективностью трансфекции. Уже давно известно, что кинетика смешивания и сборки играет важную роль в переработке LNP; Cullis et al. отметили, что быстрое конвективно-диффузионное смешивание этанола и буфера приводит к образованию мелких частиц с узким распределением по размерам, тогда как медленное диффузионное смешивание приводит к более крупным частицам с широким^{распределением по} размерам9. Временная шкала перемешивания в турбулентных смесителях CIJ уменьшается пропорционально расходу потоков на входе в смеситель²⁷. Это количественно измеряется безразмерным числом Рейнольдса (Re), которое измеряет отношение между инерционной и вязкой силами. Турбулентность внутри смесительных камер CIJ и MIVM возникает при достаточно высоком Re, так что турбулентное растяжение вихря приводит к образованию небольших масштабов длины, которые обеспечивают быстрое смешивание растворителя и антирастворителя путем диффузии. Шкала длины турбулентности зависит от Re, а не от конкретной геометрии смесительного устройства. Вот почему либо CIJ, либо MIVM производят одни и те же частицы LNP, и почему смесители MIVM разных размеров дают одни и те же размеры NP²⁷. При высоком коэффициенте Re, соответствующем высоким скоростям на входе, LNP могут быть воспроизводимы без вариаций от партии к партии (рис. 3B).

Этот протокол позволяет создавать различные мРНК, ДНК или миРНК LNP с различными физико-химическими свойствами с использованием турбулентных смесителей CIJ. В дополнение к универсальности состава и концентраций, этот метод обеспечивает четкий путь к быстрому отбору составов на стенде (несколько миллиграммов) и масштабированию свинцовых составов до больших промышленных партий со скоростью 5 л/мин³⁶. Это стало серьезным препятствием для нескольких других методов, включая смешивание объемов и микрофлюидики. Например, технологии обработки сыпучих материалов не позволяют последовательно производить LNP воспроизводимым даже в масштабах нескольких миллилитров. Микрофлюидные методы обеспечивают значительное улучшение по сравнению с методами массового смешивания, что позволяет производить однородные и воспроизводимые LNP; Однако они находятся всего в диапазоне²⁹ миллиграммов. Как подробно описано во введении, распараллеливание микрофлюидных устройств обеспечивает попытку масштабирования до производственных масштабов, но не устраняет проблему загрязнения, и оно не может быть масштабировано так же успешно, как смесители на основе технологии ограниченной струи.

Помимо этих преимуществ, смесители CIJ будут играть важную роль в производстве LNP следующего поколения, которые демонстрируют возможности нацеливания или выполняют редактирование генов. Современные составы LNP содержат липиды и нуклеиновые кислоты, которые имеют схожую диффузию, и поэтому их можно получить даже при немного плохом смешивании в лабораторных масштабах. Тем не менее, подходы к редактированию генов могут потребовать инкапсуляции форм нуклеиновых кислот с сильно различающейся молекулярной массой, таких как малые молекулы направляющей РНК и большие транскрипты мРНК, для кодирования белка CAS9³⁷. Очень разные временные масштабы диффузии этих разных видов затрудняют равномерную инкапсуляцию в стехиометрических соотношениях. Эта проблема равномерной инкапсуляции становится более выраженной по мере снижения эффективности смешивания. Аналогичным образом, для таргетирования непеченочных клеток может потребоваться включение сильно связанных медленно диффундирующих стабилизаторов (таких как блок-сополимеры с большой молекулярной массой и нацеленными лигандами). Нацеленные лиганды размером до 14 кДа могут быть конъюгированы с блокирующими сополимерами до сборки наночастиц, что позволяет равномерно встраивать их в НЧ с использованием смешивания³⁸ CIJ. Турбулентные смесители CIJ являются полезными инструментами для производства LNP, изготовленных из компонентов, имеющих различную диффузию.

Несмотря на то, что турбулентные смесители CIJ демонстрируют ряд преимуществ по сравнению с другими смесителями для составления рецептур LNP, важно отметить ограничения, связанные с каждой геометрией. Двухструйный смеситель CIJ требует, чтобы оба входных потока (этанол и вода) имели одинаковые импульсы (в пределах 10%-30%) для достижения равномерного турбулентного микроперемешивания в камере. Тот факт, что выходной поток содержит 50:50 растворитель/антирастворитель, ограничивает уровень пересыщения в смесительной полости, где происходит осаждение²⁹. Этот недостаток устраняется 4-струйным смесителем MIVM, поскольку он может использовать четыре струи с неодинаковыми импульсами для достижения условий высокого пересыщения в смесительной камере. Кроме того, оба смесителя должны иметь порядка миллиграммов от общей массы, что делает их не идеальным выбором для высокопроизводительного скрининга многих различных составов LNP. Для простых составов LNP скрининг лучше всего проводить с помощью микрофлюидики или стратегий пипетирования в микрограммовом масштабе, а затем перенести на технологию ограниченной струи после идентификации нескольких ведущих составов. Также важно учитывать мертвые объемы в смесителях. В КСЖ, двух струйных смесителях, объемы удержания составляют 50-100 микролитров. Это количество материала необходимо вычесть из количества, захваченного в закалочной ванне, при расчете восстановления от процесса. Эти потери незначительны при работе в больших масштабах, но составят 10% потерь при производстве общего объема 5 мл, как показано здесь. Ударные струйные турбулентные смесители являются ценным инструментом для производства LNP в масштабе GMP, о чем свидетельствуют две вакцины против COVID-19, одобренные FDA.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Стипендия NSF для BKW (DGA1148900), поддержка от Tessera Therapeutics Inc., Фонда Билла и Мелинды Гейтс (BMGF, номера контрактов OPP1150755 и INV-041182) и FDA по гранту 75F40122C00186.

Materials

18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Helper lipid
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305167
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165306
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Polar Lipids	890900	Ionizable lipid
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mL	Millipore Sigma	UFC910024
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2620
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)	Trilink Biotechnologies	L-7202
Confined Impinging Jets Mixer	Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Ionizable lipid
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Polar Lipids	880151P	PEG-lipid
DODMA	Avanti Polar Lipids	890899P	Ionizable lipid
Ethanol 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Fetal Bovine Serum, certified, United States	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, free acid	IBI Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 ETFE tubing ” OD 0.093” ID	Idex Health & Science	1648
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fitting	Idex Health & Science	P-678
Idex P-940 ferrule for ETFE tubing	Idex Health & Science	P-940
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers
Mixer stand	Holland Applied Technologies	N/A	See Markwalter & Prud'homme for design.²⁶ Contact Holland for Purchase
Multi-Inlet Vortex Mixer	Holland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation
O-ring (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Outlet ferrule – CIJ	Idex Health & Science	P-200	Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet fitting – CIJ	Idex Health & Science	P-205	Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet fitting – MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combination with ferrule
Outlet tubing – CIJ	Idex Health & Science	1517	Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber
Outlet tubing – MIVM	N/A	N/A	Fit to ferrule ID.
PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	N/A
Plastic two-piece syringe 1 mL	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Plug fitting	Idex Health & Science	P-309	Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurin, Sodium Salt	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Scintillation vial	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mL	SGE	100MR-LL-GT
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mL	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Sodium Acetate	Millipore Sigma	32319-500G-R
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S320-500
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-1KG
Syringe Filters, Sterile	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Water, Endotoxin Free	Quality Biological	118-325-131	RNAse and DNAse free
Yeast RNA (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM7118

References

Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -. S., Jadhav, S. G. Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape. Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).
Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery. Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).
Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery. ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).
Semple, S. C., et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol. 28 (2), 172-176 (2010).
Lam, K., et al. Unsaturated, trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), 2209624 (2023).
Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).
Jürgens, D. C., et al. Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques – an evaluation of particle properties and efficiency. OpenNano. 12, 100161 (2023).
Wang, X., et al. Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery. Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).
Yanez Arteta, M., et al. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).
Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).
Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).
Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems. J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).
Prakash, G., et al. Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids. Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197 (2022).
Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application. Pharmaceutics. 14 (1), 141 (2022).
Webb, C., et al. Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes. Int J Pharm. 582, 119266 (2020).
Warne, N., et al. Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021. Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer. Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).
Hogarth, C., et al. Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles. J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).
Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37 (2012).
D’addio, S. M., Prud’homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Phys Rev Lett. 91 (11), 118302 (2003).
Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).
Markwalter, C. E., Prud’homme, R. K. Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE J. 49, 2264-2282 (2003).
Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud’homme, R. K. Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles. J Vis Exp. (143), e58757 (2019).
Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform. J Vis Exp. 168, e62226 (2021).
Bizmark, N., et al. Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers. Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083 (2024).
Zhang, C., et al. Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy. Molecules. 27 (6), 1943 (2022).
Kulkarni, J. A., et al. Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads. Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).
El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing. J Vis Exp. (191), e64810 (2023).
Scalzo, S., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes. Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).
Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud’homme, R. K. Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale. J Transl Med. 17 (1), 200 (2019).
Kazemian, P., et al. Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components. Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).
Pinkerton, N. M. . Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. , (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Subraveti, S. N., Wilson, B. K., Bizmark, N., Liu, J., Prud’homme, R. K. Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers. J. Vis. Exp. (210), e67047, doi:10.3791/67047 (2024).