Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers

Sai Nikhil Subraveti; Brian K. Wilson; Navid Bizmark; Jason Liu; Robert  K. Prud&#39;homme

doi:10.3791/67047

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bio-ingénierie

توليف الجسيمات النانوية الدهنية عن طريق التدفق المضطرب في الخلاطات النفاثة المحصورة

Published: August 23, 2024

doi:

10.3791/67047

Sai Nikhil Subraveti¹, Brian K. Wilson¹, Navid Bizmark¹, Jason Liu¹, Robert K. Prud’homme¹

¹Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University

Summary

تم عرض بروتوكول مفصل لتوليف الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) باستخدام تقنيات الخلاط النفاث المحصور (CIJ) ، بما في ذلك CIJ ثنائي النفاثات وخلاط دوامة متعدد المدخل رباعي النفاثات (μMIVM). تولد خلاطات CIJ بيئات خلط دقيقة مضطربة وقابلة للتكرار ، مما يؤدي إلى إنتاج LNPs أحادية التشتت.

Abstract

أثبتت الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) إمكاناتها الهائلة كوسيلة توصيل علاجية ، كما يتضح من الموافقة والاستخدام العالمي لقاحين من الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) ل COVID-19. على نطاق صغير ، غالبا ما يتم تصنيع LNPs باستخدام الموائع الدقيقة. ومع ذلك ، فإن قيود هذه الأجهزة تحول دون استخدامها على نطاق واسع. يتم تصنيع لقاحات COVID-19 بكميات كبيرة باستخدام خلاطات مضطربة محصورة (CIJ). تتيح تقنية CIJ الإنتاج على نطاق المختبر مع الثقة في إمكانية توسيع نطاقه إلى أحجام الإنتاج. المفاهيم الأساسية في خلط CIJ هي أن طول الخلط ومقياس الوقت يتم تحديدهما من خلال شدة الاضطراب في تجويف الخلط وأن تكوين الجسيمات النانوية يحدث بعيدا عن الجدران ، مما يلغي مشكلة الترسب على الأسطح والقاذورات. يوضح هذا العمل عملية صنع LNPs باستخدام تقنية الخلاط النفاث المحصور مع شكلين هندسيين: CIJ ثنائي النفاثات وخلاط دوامة متعدد المدخل رباعي النفاثات (MIVM). تتم مناقشة مزايا وعيوب كل هندسة خلط. في هذه الأشكال الهندسية ، تتشكل LNPs عن طريق الخلط السريع لتيار المذيبات العضوية (عادة الإيثانول الذي يحتوي على الدهون المؤينة ، والدهون المشتركة ، وتثبيت دهون PEG) مع تيار مائي مضاد للمذيبات (عازل مائي يحتوي على الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي). يتم تقديم معلمات التشغيل لخلاطات CIJ و MIVM لإعداد LNPs القابلة للتكرار مع الحجم المتحكم فيه ، وإمكانات زيتا ، والاستقرار ، وفعالية النقل. كما يتم عرض الاختلافات بين LNPs المصنوعة من خلط ضعيف (محاليل الماصات) مقارنة بخلط CIJ.

Introduction

تحمل العلاجات القائمة على mRNA إمكانات كبيرة لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض والوقاية منها ، بما في ذلك الأمراض المعدية والاضطرابات الوراثية والسرطانات¹. على عكس العلاجات ذات الجزيئات الصغيرة ، والتي يمكن أن تنتشر بشكل سلبي عبر غشاء الخلية ، يجب تغليف الأحماض النووية للتوصيل داخل الخلايا². يوفر التغليف كلا من البنية والاستقرار ل mRNA ، مما يسهل توصيلها داخل الخلايا عبر المسارات الداخلية وكذلك منع التدهور من المكونات داخل وخارج الخلية مثل النيوكليازات³. تم تطوير مجموعة من المواد والناقلات النانوية لتغليف وتوصيل mRNA ، بما في ذلك الجسيمات النانوية غير العضوية والبوليمرات والدهون والمواد الشبيهة بالدهون¹. من بين هذه ، برزت LNPs كمنصة توصيل أبرز للعلاجات القائمة على mRNA⁴.

تتكون LNPs من أربعة مكونات دهنية: الدهون المؤينة ، والكوليسترول ، والدهون zwitterionic ، ومثبت الدهون^PEG-5. تظهر الدهون المؤينة المناسبة لتوصيل mRNA توازنا دقيقا بين الكارهة للماء الدهني وثابت التفكك (pKa) لمجموعة أمين ثلاثية⁶. عادة ما يكون للدهون المؤينة pKa درجة حموضة بين 6.0 و 6.7 ، مثل KC-2 (DLin-KC2-DMA) و MC-3 (DLin-MC3-DMA) و ALC-0315⁷. يتيح تقييد pKa هذا على الدهون المؤينة تغليف بوليمرات الحمض النووي كأملاح دهنية كارهة للماء والتوصيل داخل الخلايا من خلال عملية “هروب الإندوسوم”. تدخل LNPs الخلية المستهدفة من خلال مسارات البطانة (المختلفة) التي تتضمن جميعها تحمض الإندوسوم من الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى الرقم الهيدروجيني ~ 5⁸. يضمن pKa الدهني المؤين أن LNPs لها أسطح محايدة تقريبا في ظل الظروف الفسيولوجية ولكنها تصبح كاتيونية في الإندوسوم^{الحمضي 9}. تتيح استجابة الأس الهيدروجيني هذه تعطيلا انتقائيا للغشاء الإندوسومي فقط ، وإطلاق بوليمر الحمض النووي المغلف ، وتحافظ على صلاحية الخلية ، على عكس الدهون الموجبة الدائمة المستخدمة في أنظمة النقل مثل ليبوفيكتامين. الكوليسترول هو جزيء خلالي كاره للماء في بنية LNP يحسن سيولة الدهون. تلعب الدهون zwitterionic دورا هيكليا وتشكل طبقة ثنائية على سطح LNP. بولي (جلايكول الإثيلين) – الدهون (PEG-lipid) هو مثبت غرواني يعزز استقرار LNP عن طريق نقل مثبت ستيريك بوليمري على سطح LNP ، والذي يقاوم تجميع LNPs. هذا يعمل على استقرار LNP ، خاصة أثناء التغيرات في درجة الحموضة التي تجدد الشكل الأساسي الحر للدهون المؤينة التي تتصرف مثل الزيت الكارهة للماء. غالبا ما تستخدم وصفة Onpattro (patisiran) (المشار إليها فيما يلي باسم صياغة LNP) كنقطة انطلاق لصياغة LNP مع الدهون المؤينة MC3 والكوليسترول و distearoylphosphatidylcholine (DSPC) و PEG2000-DMG المذاب في الإيثانول الممزوج بمحلول مائي من RNA¹⁰.

يمكن استخدام العديد من التقنيات لتصنيع LNPs التي تغلف بوليمرات الحمض النووي ، حيث يعتمد معظمها على موضوع مشترك يتمثل في الخلط السريع لتيار الإيثانول الذي يحتوي على الدهون مع تيار مائي يتضمن الحمض النووي محل الاهتمام (siRNA أو mRNA أو DNA)⁹^،¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴. في هذا الصدد ، تقدم عمليات الخلط السائبة مثل خلط الماصة وخلط الدوامة استراتيجية بسيطة لتشكيل LNPs تلغي الحاجة إلى استخدام أدوات متطورة¹². ومع ذلك ، لا يوفر الخلط بالجملة توزيعا متجانسا للمكونات ، مما يؤدي إلى توزيع حجم LNP دون المستوى الأمثل جنبا إلى جنب مع تباين كبير من دفعة إلى أخرى¹⁵.

تستخدم المختبرات بشكل روتيني تقنيات خلط الموائع الدقيقة للحصول على LNPs القابلة للتكرار من خلال تحقيق تحكم أكثر دقة في ظروف الخلط¹²^،¹³^،¹⁶. ومع ذلك ، فإن ظروف التدفق الصفحي في أجهزة الموائع الدقيقة ، والتي تكون متأصلة بسبب مقاييس الطول الصغيرة والسرعات المنخفضة في غرفة الموائع الدقيقة ، تؤدي إلى خلط بطيء نسبيا للمذيبات / مضادات^{المذيبات 17}. تحد أبعاد الغرفة الصغيرة بشدة من الإنتاجية وقابلية التوسع اللازمة لإنتاج GMP من LNPs ، لكن الباحثين قاموا بموازاة غرف الموائع الدقيقة لمحاولة توسيع حجم الإنتاج¹⁵. لا تقضي هندسة الموائع الدقيقة المتوازية على مشكلة امتزاز الدهون للأسطح أثناء المعالجة ذات الحجم الكبير ، وهي مشكلة يشار إليها عادة باسم “تلوث” جهاز الخلط ، وهناك مشاكل في توحيد واستقرار التدفقات التي تجعل توسيع الموائع الدقيقة تحديا للإنتاج على نطاق صناعي^18,19. ليس من المستغرب أن تستخدم شركات الأدوية الخلاطات النفاثة المضطربة لتصنيع لقاح COVID-19 mRNA-LNPs²⁰.

تستلزم عملية إنتاج LNPs المحملة بالحمض النووي الريبي مزج تيار عازل مائي يحتوي على حمولة الحمض النووي الريبي مع تيار إيثانول يحتوي على مكونات الدهون الأربعة المتميزة. تستخدم هذه التركيبات عازلا حمضيا بأس هيدروجيني 4.0 أو أقل ، والذي يشحن الدهون المؤينة مع اختلاط التيارات المائية والإيثانولية. تتفاعل الدهون المؤينة الموجبة الشحنة كهروستاتيكيا مع الحمض النووي الريبي سالب الشحنة ، مكونا ملح دهون الحمض النووي الريبي الكارهة للماء. تترسب أنواع الدهون الكارهة للماء ، بما في ذلك ملح الدهون RNA ، في المذيبات المختلطة وتشكل نوى كارهة للماء. تنمو هذه النوى من خلال ترسيب الدهون zwitterionic والكوليسترول حتى تصل إلى نقطة حرجة حيث تمتص الدهون pegylated كافية على سطح LNPs ، مما يوقف المزيد من النمو – النوى وآلية النمو²¹^،²²^،²³. تتوقف إضافة المخزن المائي إلى محلول الدهون ، إلى الحد الذي تترسب فيه الدهون وتتشكل LNPs ، على مقياسين زمنيين متميزين: فترة خلط المذيبات ومضادات المذيبات ، τ_mix ، وفترة نمو النوى ، τ_agg. يجسد رقم Damköhler عديم الأبعاد ، الذي يعرف بأنه Da = τ_mix / τ_agg ، التفاعل بين هذه المقاييس الزمنية²⁴. في حالات الخلط البطيء (Da > 1) ، يتم التحكم في الحجم النهائي ل LNPs بالنقل ويختلف مع وقت الخلط. على العكس من ذلك ، أثناء الخلط السريع (Da < 1) ، يتم تجزئة السائل إلى تشققات أو طبقات بطول Kolmogrov ، حيث يتم التحكم في تكوين LNP فقط من خلال الانتشار الجزيئي لكل مكون ، مما يؤدي إلى حركية متجانسة لتشكيل LNP. يتطلب تحقيق السيناريو الأخير أن يتجاوز تركيز الدهون عتبة حرجة ، مما يؤدي إلى حالة من التشبع الفائق تفضي إلى نواة متجانسة موحدة.

تشير التقديرات إلى أن τ_agg يتراوح من بضع عشرات إلى بضع مئات من المللي ثانية²⁵. في تكوينه الأساسي ، يتم حقن التيارين ، أحدهما يحتوي على الإيثانول مع الدهون والآخر يحتوي على عازل مائي مع شحنة الحمض النووي الريبي ، في غرفة تعرف باسم خلاط “نفاثة اصطدام محصورة” (CIJ). تنتج الدوامات المضطربة مقاييس طول تشقق المذيبات / مضادات المذيبات تبلغ 1 ميكرومتر في غضون 1.5 مللي ثانية عند تشغيلها بسرعات مناسبة. تحدد سرعات التيار وهندسة الخلط تحويل الزخم الخطي إلى دوامات مضطربة تخلط الجداول. يتم تحديد هذا بواسطة الرقم عديم الأبعاد ، رقم رينولدز (Re) ، والذي يتناسب خطيا مع سرعات التدفق. يتم حساب Re من Re = Σ (V_iD_i / v_i) ، حيث V_i هي سرعة التدفق في كل بخار ، v _i هي اللزوجة الحركية لكل تيار ، و D_i هو قطر مدخل التيار في أجهزة CIJ 2-jet²⁶ أو قطر الغرفة في 4-jet MIVMs²⁷. ملاحظة: تستخدم بعض المراجع الخاصة ب CIJ قطر وسرعة نفاثة واحدة فقط لتعريف Re²⁸. Re في حدود 1-100 في جهاز الموائع الدقيقة ، بينما في أجهزة CIJ ، يمكن تحقيق Re من 125,000. في خلاط CIJ ، تصطدم الجداول ذات الزخم المتساوي ، مما يبدد زخمها عند الاصطدام بالخلط المضطرب ، مما يؤدي إلى خلط دقيق فعال بسبب المقاييس المجهرية الصغيرة ل Kolmogorov ورقم Damköhler الصغير. نوع آخر من الخلاطات هو “خلاط دوامة متعدد المدخلات” (MIVM) ، حيث يتم توجيه أربعة تيارات إلى غرفة مركزية. في هذا الإعداد ، تضمن التدفقات المستمرة إلى غرفة الخلط المحصورة مقياس وقت خلط محدد جيدا. تمر جميع عناصر السوائل عبر منطقة الخلط عالية الطاقة في كلا النوعين من الخلاطات. في المقابل ، لا تحتوي أجهزة الخلط البسيطة مثل تقاطعات T على غرفة توفر منطقة خلط ، مما يؤدي إلى اختلاط أقل بين التيارين بسبب انحراف زخم التيار الوارد إلى حد كبير إلى اتجاه المخرج بدلا من توليد دوامة مضطربة. يمكن تشغيل كل من خلاطات CIJ و MIVM في أوضاع دفعية أو مستمرة ، مما يوفر المرونة لإنتاج LNP على مستويات مختلفة.

يصف هذا البروتوكول كيفية صنع تركيبات LNP المثلى من خلال استخدام تقنيتين نفاثتين محصورتين: 2-jet CIJ وخلاطات MIVM ذات 4 نفاثات. تم إثبات تشغيل خلاطات CIJ و MIVM سابقا لإعداد NPs بمواد أساسية كارهة للماء²⁹. يجب الرجوع إلى هذه المقالة والفيديو كمورد إضافي حول تكوين NPs مع هذه الخلاطات. يركز هذا التحديث على تكوين NP القائم على الدهون. تم إثبات القدرة على ضبط حجم LNPs عن طريق تغيير ظروف الخلط الدقيق. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر فائدة تقنيات CIJ في تكوين LNPs مستقرة وأحادية التشتت مع تحسين كفاءات النقل في المختبر في خلايا HeLa عند مقارنتها ب LNPs المصنوعة باستخدام خلط ماصة ضعيف. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة مزايا وعيوب كل هندسة خلط CIJ ، إلى جانب الظروف المناسبة اللازمة لتوسيع نطاق هذه الخلاطات.

Protocol

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد. 1. تحضير المخازن المؤقتة وتيارات المذيبات ومضادات المذيبات قم بإذابة جميع مكونات الدهون في الإيثانول بتركيزات كتلة معينة ، كما هو موضح في الجدول 1 ، لعمل تركيبة باتيسيران LNP10. قبل الاستخدام ، قم بتسخين المحاليل إلى 37 درجة مئوية مع صوتنة لطيفة لإعادة إذابة أي مواد صلبة مترسبة.ملاحظة: يمكن تحضير محاليل مخزون أكبر من عدة ملليلتر وتخزينها عند 4 درجات مئوية. تحضير محلول مخزون احتياطي من الأسيتات بتركيز 100 mM ، الرقم الهيدروجيني 4 ، من خلال الجمع بين 186 مجم من أسيتات الصوديوم و 464 مجم من حمض الأسيتيك في 80 مل من الماء الخالي من النيوكلياز. اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز أو هيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة وقم بتكوين الحجم النهائي إلى 100 مل. تحضير محلول مخزون HEPES العازل بتركيز 1 M ، درجة الحموضة 7.5 ، عن طريق إذابة 23.82 جم من ملح HEPES في 80 مل من الماء الخالي من النيوكلياز. اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز أو هيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة وقم بتكوين الحجم النهائي إلى 100 مل. قم بتخفيف بوليمر الحمض النووي محل الاهتمام والمخزون العازل من الأسيتات 100 مللي متر بالماء الخالي من النيوكلياز لإنتاج محلول 300 ميكروغرام / مل من الحمض النووي الريبي في محلول خلات 30 مللي مول. قم بإعداد حجم مناسب من حل العمل للتجارب المصممة ، ويتطلب هذا البروتوكول إجمالي 1500 ميكرولتر لكل من خلاطات CIJ و MIVM.ملاحظة: سيكون الحمض النووي الريبي الذي يتم الحصول عليه من المورد بالفعل في مخزن مؤقت مناسب ، عادة بتركيز 10 مجم / مل (خميرة الحمض النووي الريبي) أو 1 مجم / مل (mRNA المشفر لوسيفيراز ، LucRNA ، أو GFP المشفر mNA ، GFP-RNA). يمكن استخدام الحمض النووي الريبي الخميرة كنموذج منخفض التكلفة للحمض النووي الريبي لهطول الأمطار. 2. صياغة LNPs باستخدام خلاط CIJ ثنائي النفاثات إعداد وتنظيف المعداتنظف خلاطات CIJ مباشرة قبل الاستخدام عن طريق شطف الخلاط بالإيثانول. املأ حقنتين سعة 5 مل بالإيثانول وأغلق كل منهما في منفذ مدخل CIJ. قم بالضغط بسرعة على المحاقن وجمع النفايات السائلة للخلاط كنفايات.ملاحظة: يمكن إنشاء خلاطات CIJ وتشغيلها كما هو موضح سابقا29. يمكن استخدام حوامل دعم مختلفة لحمل خلاط CIJ ، بما في ذلك حامل حلقي أو حامل أنبوب طرد مركزي أو قارورة Erlenmeyer. يتم سرد موردي CIJ في جدول المواد والملف التكميلي 1. قم بإزالة محاقن تدفق الإيثانول من CIJ. يمكن تخزين هذه المحاقن وإعادة استخدامها لشطف الإيثانول الإضافي ل CIJ. قم بتجفيف القنوات الداخلية ل CIJ عن طريق نفخ تيار نيتروجين جاف من خلال محولات المدخل. استخدم فقط الهواء الجاف المصفى غير الملوث برذاذ زيت المضخة أو الهباء الجوي إذا لم يكن النيتروجين متاحا. تحضير تيارات المذيبات ومضادات المذيباتامزج محاليل مخزون الدهون وقم بتخفيفها بإيثانول إضافي لإنتاج 500 ميكرولتر من محلول الدهون 6 مجم / مل المدرج في الجدول 1 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.ملاحظة: هذه التركيبة هي تركيبة Onpattro شائعة الاستخدام التي تحتوي على 50٪ مول MC3 ، 10٪ مول DSPC ، 38.5٪ مول كوليسترول ، و 1.5٪ مول DMG-PEG2000. قم بتخفيف مخزون الأس الهيدروجيني 4 المخزن المؤقت 100 mM pH 4 إلى 10 mM في حجم إجمالي قدره 4 مل كحمام إخماد النفايات السائلة في خلاط CIJ.ملاحظة: يمكن أيضا إضافة قضيب تحريك مغناطيسي إلى حمام التبريد. اسحب 500 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الريبي المحضر في الخطوة 1.4 في حقنة سعة 1 مل. اقلب المحقنة واطرد أي هواء من هذا التيار المائي المضاد للمذيبات الذي يحتوي على بوليمر الحمض النووي. اسحب 500 ميكرولتر من محلول الدهون المحضر في الخطوة 2.2.1 في حقنة سعة 1 مل. اقلب المحقنة واطرد أي هواء من تيار المذيب الإيثانولي الذي يحتوي على ليبيدات. إنتاج LNP في خلاط CIJضع خلاط CIJ النظيف فوق قارورة حمام التبريد.ملاحظة: يوفر مشبك الحامل الحلقي أو الرف الأنبوبي دعما مناسبا لخلاط CIJ. انظر الشكل 1A لإعداد CIJ نموذجي. قم بربط المحقنتين المملوءتين في الخطوة 2.2.3 والخطوة 2.2.4 بمنافذ مدخل خلاط CIJ. قم بضغط كلا المحاقن بسرعة لخلط تيارات المذيبات ومضادات المذيبات وجمع NPs الدهنية في حمام التبريد.ملاحظة: يجب أن تكون المحاقن متقدمة بسرعة (في أقل من 1 ثانية) ولكن بسلاسة وموحدة. سيؤدي التدفق غير المتماثل أو التدفق البطيء إلى إنتاج LNPs كبيرة ومتعددة التشتت. قم بإزالة خلاط CIJ من فوق حمام التبريد مع استمرار المحاقن المرفقة.ملاحظة: لا تقم بإزالة المحاقن أو السماح لحجم الانتظار بالتدفق إلى حمام التبريد ، لأن هذه المادة مختلطة بشكل سيئ وستؤثر سلبا على خصائص تشتت الإنتاج إذا تم خلطها في حمام التبريد. أمسك CIJ فوق حاوية نفايات وقم بإزالة المحاقن ، مما يسمح لحجم الاحتجاز المتبقي بالتدفق إلى حاوية النفايات. تخلص من هذه المحاقن وكرر عملية التنظيف كما هو موضح في القسم 2.1. تحليل LNPs المنتجة مع CIJ كما هو موضح في القسم 5 أدناه. 3. صياغة LNPs باستخدام خلاط MIVM رباعي النفاثات تجميع خلاط MIVM ، يشار إليه باسم MIVM صغير الحجم (μMIVM) لتمييزه عن الطرز الأكبر المستخدمة في الإنتاج الموسعاجمع كل المكونات الفردية المطلوبة لتجميع خلاط MIVM: جهاز الاستقبال السفلي ، وقرص هندسة الخلط ، والقرص العلوي ، والحلقة O ، ومفتاح ربط الربط.ملاحظة: تم عرض بناء MIVM وتجميعه وتشغيله سابقا لتغليف الأنواع الكارهة للماء ، وتم سرد الموردين في الملف التكميلي 1 وجدول المواد29. انظر الشكل 2 للحصول على مخطط للمكونات ومصطلحات حامل الخلاط. ضع الحلقة O في الأخدود الموجود في قرص الخلط. قم بمحاذاة فتحات قرص الخلط مع الأوتاد الموجودة على القرص العلوي وادفعها معا دون إزاحة الحلقة O. قم بربط قرص الخلط المتزاوج والحلقة O ومجموعة القرص العلوي في جهاز الاستقبال السفلي بشكل غير محكم.ملاحظة: قم بإزالة أنبوب المخرج من جهاز الاستقبال السفلي قبل هذه الخطوة. أحكم ربط القرص العلوي في جهاز الاستقبال السفلي باستخدام مفتاح ربط مفتاح الربط.ملاحظة: يمكن تطبيق مركب مضاد للتشنج من الدرجة الغذائية أو الصيدلانية على خيوط القرص العلوية إذا لوحظ وجود خلل في الخيط. أدخل وشد أنبوب المخرج المناسب في جهاز الاستقبال السفلي لإكمال MIVM. قم بتركيب MIVM المجمع في حامل الخلاط بحيث يخرج أنبوب المخرج من خلال لوحة الدعم.ملاحظة: يجب تنفيذ إجراء ضبط حامل الخلاط MIVM بشكل دوري للتأكد من تكوين التوقفات الميكانيكية على حامل الخلاط بشكل صحيح29. تحضير تيارات المذيبات ومضادات المذيباتامزج محلولي تيار المذيبات الدهنية الإيثانولية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، كما هو موضح في الجدول 2 ، عن طريق تخفيف محاليل مخزون الدهون وإضافة إيثانول إضافي حسب الحاجة للوصول إلى تركيز دهون نهائي قدره 6 مجم / مل.ملاحظة: هذا هو نفس تكوين محلول الدهون كما في 2.2.1 ولكن بحجم إجمالي 1000 ميكرولتر. قم بتخفيف مخزون الأس الهيدروجيني 4 المخزن المؤقت 100 mM pH 4 إلى 10 mM في حجم إجمالي قدره 8 مل كحمام إخماد النفايات السائلة MIVM.ملاحظة: يمكن أيضا إضافة قضيب تحريك مغناطيسي إلى حمام التبريد. صياغة LNPs باستخدام خلاط MIVMضع حمام التبريد سعة 8 مل أسفل حامل الخلاط بحيث يتم تفريغ أنبوب التدفق الخارجي في حمام التبريد. ارسم تيارات المذيبات ومضادات المذيبات في محاقن مانعة لتسرب الغاز سعة 1 مل باستخدام إبرة حادة. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء وتخلص من الإبرة. قم بتجهيز كل حقنة عن طريق قلب وطرد أي هواء من المحقنة. قم بتجميع المحاقن الأربعة في الخلاط في اتجاه عقارب الساعة (المحاقن 1-4 ، الجدول 2) مع نفس التدفقات على الجانبين المقابلين. انظر الشكل 1B للحصول على مخطط المظهر النهائي. امسك غلاف المحمل على جانبي اللوحة المتحركة. تجنب وضع الأصابع على الوجه السفلي للسكن ، لأن هذا يشكل خطر قرصة بسبب التوقفات الميكانيكية. قم بخفض اللوحة المتحركة بعناية حتى تستقر بالتساوي على المحاقن.ملاحظة: يجب أن تكون جميع غطاسات المحقنة على ارتفاع متساو قبل التشغيل. قم بالضغط على اللوحة بثبات وسلاسة ، بهدف إكمال العملية في حوالي 0.5 ثانية إلى 1 ثانية لأحجام التيار هذه. قم بتغطية حمام التبريد الذي يحتوي على تشتت LNP. قم بإجراء تنظيف MIVM بعد الاستخدام ، باتباع الإرشادات الواردة في الخطوة 3.5 أدناه. تركيب LNPs باستخدام خلاط MIVM مدفوع بمضخة حقنةقم بتجميع MIVM كما هو موضح في الخطوة 3.1. تحضير المحاليل المذيبة والمضادة للذوبان في التركيبة المطلوبة وبحجم كاف لحجم التركيبة المطلوب (الجدول 3).ملاحظة: هذه هي نفس التركيبات مثل تيارات مضادات المذيبات المائية (الخطوة 1.4) والمذيب الإيثانولي (الخطوة 3.2.1) ولكن تم توسيع نطاقها للاستخدام مع أحجام المحاقن الأكبر في الجدول 3. قم بتحميل المحاليل في محاقن مانعة لتسرب الغاز بحجم 20 مل وقم بتوصيل أنابيب PTFE بمحول luer مثبت في النهاية. قم بتجهيز المحاقن والأنابيب عن طريق قلب المحقنة والأنابيب ثم طرد أي هواء. قم بتركيب المحاقن في مضخة حقنة وقم بتوصيل المحاقن بمداخل الخلاط على MIVM ، كما هو موضح في الشكل 3 أ.ملاحظة: يمكن أيضا تشغيل CIJ عبر المضخات بنفس الطريقة ولكن مع حقنة واحدة فقط مضادة للمذيبات والمذيبات. قم بتخفيف مخزون الأس الهيدروجيني 4 المخزن المؤقت 100 مللي متر إلى 10 مللي مول في حجم إجمالي قدره 320 مل كحمام إخماد للنفايات السائلة MIVM. ضع حمام التبريد أسفل منفذ MIVM. اضبط معدل التدفق الحجمي على مضخة المحقنة على 20 مل / دقيقة.ملاحظة: قد تختلف معدلات التدفق الحجمي من 2 مل / دقيقة إلى 40 مل / دقيقة عن طريق تعيين القيم يدويا على مضخة المحقنة لتشكيل LNPs مع ظروف خلط دقيقة مختلفة. ابدأ تشغيل مضخة المحقنة ، لكن اترك أول 10 ثوان من النفايات السائلة تتدفق إلى دورق النفايات. اجمع النفايات السائلة MIVM في حمام التبريد بعد فترة تدفق بدء التشغيل البالغة 10 ثوان. قم بإزالة وتغطية حمام التبريد الذي يحتوي على تشتت LNP المصنوع بمعدل التدفق الحجمي المحدد (20 مل / دقيقة).ملاحظة: يمكن تكرار هذا الإجراء لتجميع LNPs بمعدلات تدفق مختلفة عن طريق اختيار أحجام حمام التبريد المناسبة. قم بتنظيف MIVM بين كل تجربة (عند تغيير معدل التدفق) عن طريق شطف ما لا يقل عن ضعف حجم أنبوب المخرج لمنع تجميع LNPs المصنوع في حالة معدل التدفق السابقة قبل البدء في تخليق LNP التالي. تنظيف المعدات بعد الاستخدامافصل الخلاط عن الحامل مع إبقاء المحاقن متصلة ، وأمسكه فوق حاوية نفايات. قم بإزالة المحاقن ، واترك حجم الانتظار يستنزف في الحاوية. بعد ذلك ، أمسك مجموعة الخلاط رأسا على عقب واستخدم مفتاح ربط لتفكيك الخلاط. شطف أنبوب المخرج بالمذيب (مثل الإيثانول) وجففه بالهواء أو النيتروجين. اشطف هندسة الخلط بمذيب مناسب ، مثل الماء منزوع الأيونات أو الإيثانول ، متبوعا بالشطف بالإيثانول. تجفيف المكونات باستخدام تيار من الهواء أو النيتروجين. شطف الحلقة O بالماء منزوع الأيونات وصمة عار جافة.ملاحظة: إذا بدت الحلقة O ممتدة أو مشوهة ، اتركها تجف في الهواء طوال الليل قبل استخدامها. احتفظ بمخزون كبير من الحلقات O لأنها أجزاء قابلة للاستهلاك. إذا لم يتعافى الشكل في اليوم التالي ، فتخلص من الحلقة O. شطف القرص العلوي جيدا مع المذيب ، وذلك باستخدام تيار الهواء أو النيتروجين لتجفيف السطح وتركيبات حقنة. شطف كل حقنة بمذيب جيد (على سبيل المثال ، الماء منزوع الأيونات أو الإيثانول). ضع شطفا نهائيا بالإيثانول وجففه في الهواء قبل الاستخدام التالي. 4. المعالجة اللاحقة ل LNPs تبادل العازلة وإزالة الإيثانولقم بغسيل تشتت LNP مقابل مخزن مؤقت HEPES 10 mM عند درجة الحموضة 7.4 باستخدام كاسيت غسيل الكلى بحجم مناسب مع خرطوشة غسيل الكلى ذات الوزن الجزيئي 20 كيلو دالتون.ملاحظة: تزيل هذه الخطوة الإيثانول المتبقي بنسبة 10٪ وتزيد من درجة حموضة التشتت عن طريق استبدال المخزن المؤقت للأسيتات ب HEPES. تمييع المخزون 1 M HEPES العازلة إلى 10 mM في حجم إجمالي 1 لتر. قم بتحميل تشتت LNP في كاسيت غسيل الكلى سعة 12 مل باستخدام حقنة وإبرة. اغمر خرطوشة غسيل الكلى في 1 لتر من المخزن المؤقت HEPES وحرك المخزن المؤقت الخارجي مغناطيسيا. قم بتغيير المخزن المؤقت HEPES الخارجي بعد 3 ساعات ، وقم بإزالة خرطوشة غسيل الكلى بعد 3 ساعات إضافية لإجمالي وقت غسيل الكلى 6 ساعات. اسحب تشتت LNP المجفف من خرطوشة غسيل الكلى وتخلص من الخرطوشة المستهلكة. تركيز تعليق LNP عبر الطرد المركزي الفائقماصة التعليق في مرشح طرد مركزي بحجم مناسب مع MWCO من 100kDa30.ملاحظة: تتوفر مرشحات الطرد المركزي في مجموعة من الأحجام ، عادة من 0.5 مل إلى 12 مل. أجهزة الطرد المركزي التشتت عند 2000 × جم لمدة 10-20 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة) لزيادة التركيز بعامل حوالي 5-20x.ملاحظة: أثناء الطرد المركزي ، تحقق من العينة كل 5 دقائق للتأكد من بقاء كمية مناسبة من السائل. 5. توصيف LNPs قياسات القطر الهيدروديناميكي مع تشتت الضوء الديناميكي (DLS)قم بتوزيع 750 ميكرولتر أو 900 ميكرولتر من تشتت LNP المحضر (بدون أي تخفيفات) في كفيت بلاستيكي صغير أو مربع ، على التوالي.ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الأحجام الأصغر في الأكواب المناسبة. اضبط اللزوجة المناسبة للمذيب الذي تنتشر فيه LNPs (أي 1.26 cP لخليط الإيثانول 10٪ vol٪). اجمع الضوء المرتد بزاوية 173 درجة عند 25 درجة مئوية ، متبوعا بتحديد حجم LNP باستخدام نموذج Stokes-Einstein وأول تراكم لتوسيع سلسلة وظائف ارتباط تشتت الضوء على النحو المحدد في وثيقة معيار ISO 13321: 1996 E. كرر القياسات ثلاث مرات على الأقل. قياسات زيتا المحتملةأضف ~ 800 ميكرولتر من تشتت LNP المحضر في خلايا زيتا ذات الحجم الشعري المطوي.ملاحظة: لتجنب انحباس الفقاعة داخل القناة الشعرية ، يتم توزيع نصف السائل في الخلايا ، ويتم تثبيته رأسا على عقب ، ثم تدويره. كرر القياسات ثلاث مرات على الأقل.ملاحظة: يجب أن تكون الموصلية العازلة بين 0.2-2 مللي سيمنز / سم للحصول على أفضل النتائج. قياسات كفاءة التغليف (EE) بواسطة مجموعة قياس كمية الحمض النووي الريبي المتاحة تجارياقم بتخفيف الكمية المناسبة من المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) 20x عند الرقم الهيدروجيني 7.5 المقدم في مجموعة الفحص إلى تركيز 1x باستخدام الماء الخالي من النيوكلياز. قم بإعداد محلول Triton X-100 بنسبة 2٪ بالوزن. قم بتخفيف الكمية المناسبة من تشتت LNP في المخزن المؤقت 1x TE لإنتاج تركيز كتلة إجمالي يبلغ حوالي 0.6 ميكروغرام / مل للحمض النووي الريبي ، مع محتوى الإيثانول أقل من 0.2٪. قم بإعداد عينات مماثلة كما في الخطوة السابقة ولكنها تحتوي على 0.5٪ بالوزن٪ Triton X-100 ، مما يذيب LNPs بشكل فعال ، مما يسهل التمييز بين تركيزات الحمض النووي الريبي “الحرة” والكلية في غياب ووجود Triton X-100 ، على التوالي. تحضير كميات مناسبة من محاليل الحمض النووي الريبي للتحكم بتركيزات 0 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.4 ميكروغرام / مل ، 0.6 ميكروغرام / مل ، 0.8 ميكروغرام / مل و 1.0 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت 1x TE.ملاحظة: قد تحتاج مجموعة الحمض النووي الريبي في البداية إلى التخفيف. كرر الخطوة السابقة ولكن عند 0.5٪ بالوزن٪ Triton X-100. تمييع صبغة Ribogreen (المتوفرة في المجموعة) 200 مرة في المخزن المؤقت 1x TE. أضف كميات مناسبة من صبغة ريبوجرين المخففة إلى جميع محاليل الحمض النووي الريبي والعينات المعدة ، سواء مع أو بدون Triton X-100. يجب تخفيف الصبغة بالتساوي عبر كل من الحمض النووي الريبي للتحكم ومحاليل العينة بعامل اثنين. وبالتالي ، فإن التخفيف الكلي للصبغة هو 400 مرة من تركيزها الأصلي في مجموعة الفحص. دوامة خلط الحاويات. قم بإعداد لوحة 96 بئرا ، غير معالجة ، مسطحة القاع ، غير شفافة للتحليل في قارئ اللوحة. توزيع 100 ميكرولتر من العينات وعناصر التحكم في الحمض النووي الريبي في خلايا منفصلة من اللوحة.ملاحظة: راقب تكوين الفقاعات في المحاليل التي تحتوي على Triton X-100. يتم إجراء ما لا يقل عن ثلاث مكررات لكل عينة ، تتطلب ما لا يقل عن 350 ميكرولتر من العينات. سجل شدة التألق باستخدام قارئ اللوحة بطول موجة إثارة يبلغ 485 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 528 نانومتر ، مع مدة إضاءة تبلغ حوالي 10 ثوان لكل قراءة. لا حاجة للاهتزاز.ملاحظة: يتم تحديد EE من ، حيث يمثل Iمع Triton و Iبدون Triton متوسط شدة التألق لثلاث نسخ متماثلة من العينات مع وبدون Triton X-100 ، على التوالي ، و aمع Triton و aبدون Triton تشير إلى ميل الملاءمة الخطية لمنحنيي المعايرة المتوسطين مع وبدون Triton X-100 ، على التوالي31.

Representative Results

يمكن تحقيق فحص تركيبات LNP المثلى بسرعة بكميات صغيرة نسبيا من المواد باستخدام خلاطات CIJ المضطربة ثنائية التيار ، بشرط تشغيلها بسرعات مناسبة. يتم استخدام خلاط μMIVM مدفوعا بمضخة حقنة قابلة للبرمجة ، كما هو موضح في الشكل 3 أ ، لتسليط الضوء على أهمية تحقيق خلط دقيق كاف ، فوق رقم رينولدز الحرج لتشكيل LNPs صغيرة أحادية التشتت. يحتوي الجدول 3 على ملخص للتركيبات المستخدمة لإنتاج LNPs ، ويتبع إعداد الخلاط البروتوكول الموضح في الخطوة 3.4. تميزت أحجام LNP بتشتت الضوء الديناميكي (DLS) كدالة لرقم رينولدز. كما هو موضح في الشكل 3B ، بعد Re الحرج البالغ 5000 ، لوحظت LNPs صغيرة وأحادية التشتت. علاوة على ذلك ، يمكن الوصول إلى أرقام رينولدز العالية (~ 104-10 5) عندما يتم الضغط على المحاقن بشكل موحد عن طريق التشغيل المحمول باليد أو باستخدام حامل الخلط (أقصى نقطة بيانات في الشكل 3 ب). يعمل حامل الخلط ، الموضح في الشكل 2 أ ، على خفض جميع المحاقن بشكل موحد في وقت واحد27. نتيجة لذلك ، تتمتع LNPs أيضا بأحجام مثالية. مع الخلط غير الكافي (أي صغير جدا من Re) ، يتم تشكيل LNPs أكبر. يتم عرض الصور الممثلة ل LNPs المتكونة عند انخفاض (الصورة 1) وارتفاع Re (الصورة 2) في الشكل 3B. العينات المأخوذة عند Re منخفضة عكرة ، مما يشير إلى وجود هياكل تشتت الضوء الغروية الكبيرة (تأثير تيندال) ، لكن LNPs المتكونة عند Re عالية تبدو واضحة بسبب التشتت الأضعف والأزرق من الغرويات الأصغر. الدهون المؤينة لها خصائص فيزيائية كيميائية مختلفة ، والتي تؤثر على الخصائص الفيزيائية والكيميائية ل LNPs المنتجة مع تركيبات دهنية متطابقة. يتم استخدام خلاط CIJ (الشكل 1 أ) لاختبار ذلك. يسرد الجدول 4 التركيبات المصنوعة باستخدام اثنين من الدهون المؤينة المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء: ALC-0315 و MC3. يوضح الشكل 4A أن LNPs المصنوعة عند الرقم الهيدروجيني 5 من ALC-0315 هي ~ 80 نانومتر ، في حين أن LNPs المصنوعة باستخدام MC3 هي ~ 60 نانومتر. علاوة على ذلك ، عند الرقم الهيدروجيني 5 ، يكون ل MC3-LNPs جهد زيتا إيجابي (~ 28 مللي فولت) ، في حين أن ALC-LNPs لها جهد زيتا محايد (<10 مللي فولت). ينشأ هذا التمييز في الشحنة السطحية وكذلك الحجم الكلي ل LNPs من pKa للدهنيين. يحتوي MC3 على pKa أعلى (6.44) مقارنة ب ALC0315 (6.09) 32 ؛ لذلك ، يتم شحن جزء أعلى من دهون MC3 عند الرقم الهيدروجيني 5. تحتوي كلتا التركيبتين على 1.5 مول من مثبت الدهون PEG. ومع ذلك ، فإن MC3-LNPs تستقر عند حجم أصغر بسبب التنافر الكهروستاتيكي الأكبر أثناء تجميع LNP أثناء التجميع المحدود الانتشار ، مما يوقف النمو عند الحجم الأصغر. تظهر كلتا التركيبتين كفاءة تغليف عالية (>90٪) ، كما هو موضح في الشكل 4B. تعتبر كيمياء الدهون أمرا بالغ الأهمية في تحديد الخصائص الكلية وكذلك أداء LNPs ، وبالتالي ، يجب اختيارها بعناية بناء على التطبيق المستهدف. LNPs المصنوعة باستخدام كل من هندسة الخلاط المضطرب (الخطوة 2.3 والخطوة 3.3) لها خصائص فيزيائية كيميائية مماثلة. تمتد هذه المقارنة إلى LNPs المصنوعة من تقنيات الخلط السيئة ، مثل خلط الماصة السائبة ، لتوضيح التمييز بين الخلاطات المضطربة وتقنيات الخلط غير المنتظمة (الشكل 1C). ويقدم الجدول 5 موجزا للتركيبات المستخدمة في صنع LNPs، كما هو مبين في الشكل 5. في حالة تقنية خلط الماصة ، يتم خلط كميات متساوية من الإيثانول والتيارات المائية بسرعة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لمدة 15-20 ثانية ، متبوعا بسحب الخليط في حمام عازل من الأسيتات عند درجة الحموضة 4. يوضح الشكل 5 أ أن أحجام LNPs في حمام إخماد 10 mM acetate العازلة (الرقم الهيدروجيني 4 ، 10٪ حجم الإيثانول) متشابهة بشكل لافت للنظر وصغيرة (~ 50 نانومتر) بغض النظر عن هندسة الخلاط المستخدمة (CIJ أو MIVM). ومع ذلك ، فإن LNPs المصنوعة باستخدام خلط الماصة هي ضعف حجم LNPs المصنوعة باستخدام الخلاطات المضطربة. هذا يدل على أن LNPs المصنوعة من أشكال هندسية مختلفة CIJ تظهر خصائص مماثلة عند تصنيعها بسرعات عالية بما فيه الكفاية (نظام مضطرب فوق رقم رينولدز الحرج) ، في حين أن الخلط السيئ يؤدي إلى LNPs أكبر ومتعدد التشتت. بعد ذلك ، يتم تحليل LNPs مقابل مخزن مؤقت HEPES 10 mM ، الرقم الهيدروجيني 7.4 (حجم 100x) ، لإزالة الإيثانول وتحويل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. خلال هذه العملية ، هناك بعض اندماج LNP والنمو إلى حجم أكبر قليلا ، كما هو موضح في الشكل 5A ، والذي يتماشى مع آلية الاندماج المدروسة جيدا في الأدبيات33. بشكل عام ، فإن LNPs المصنوعة باستخدام خلاطات CIJ و MIVM أقل من 100 نانومتر ، في حين أن LNPs المصنوعة باستخدام خلط الماصة تبلغ حوالي 140 نانومتر. كما هو موضح في الشكل 5B ، فإن جهود زيتا لهذه التركيبات أقل من 10 mV ، مما يشير إلى أنها جميعا محايدة عند الرقم الهيدروجيني 7.4. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر جميعها كفاءات تغليف عالية تبلغ >95٪ (الشكل 5C). وبالتالي ، يمكن تصنيع LNPs ذات الخصائص الفيزيائية والكيميائية المثلى بسهولة باستخدام تقنيات الخلاط المضطرب. يتم تقييم أداء هذه LNPs من خلال إجراء نقل في المختبر في خلايا هيلا. تم اعتماد بروتوكول مقايسة النقل في المختبر القائم على Luciferase من منشور سابق34. يرسم الشكل 6A التلألؤ (RLU) لكل 1000 خلية للتركيبات الثلاث الملخصة في الجدول 5. يستخدم ليبوفيكتامين 3000 كعنصر تحكم إيجابي. من المهم ملاحظة أن ليبوفيكتامين 3000 يستخدم بشكل عام لتركيبات الحمض النووي. ومع ذلك ، فقد عملت كعنصر تحكم مناسب في هذه التجارب. LNPs المصنوعة باستخدام خلاطات CIJ 2-jet و 4-jet MIVM أفضل بكثير من LNPs المصنوعة باستخدام خلط الماصة. على الرغم من أنه من المتوقع أن تنتقل الجسيمات الأكبر بشكل أفضل من الجسيمات الصغيرة بسبب الحمولة الأكبر لكل LNP ، فإن LNPs المصنوعة باستخدام خلط الماصة هنا تنقل بشكل أقل فعالية. وهذا يعني بوضوح أن هناك اختلافا كبيرا في هياكل LNPs المصنوعة من تقنيات CIJ مقارنة ب LNPs المصنوعة من خلط الماصات. إن كفاءات النقل ل LNPs المصنوعة من خلاطات CIJ و MIVM متطابقة بشكل أساسي. يظهر ليبوفيكتامين 3000 أدنى كفاءة في النقل. يقيم الشكل 6B سمية LNP في المختبر على خلايا HeLa باستخدام مقايسة صلاحية الخلية على أساس ملح resazurin الصوديوم35. تظهر جميع التركيبات سمية خلوية منخفضة ، تظهر من خلال مستويات عالية من صلاحية الخلية عند رسمها كنسبة مئوية من الخلايا الحية مقابل التحكم الذي لا يحتوي على أي علاج بالجسيمات النانوية. الشكل 1: طرق الخلط لإنتاج LNPs. (أ) الخلاط النفاث المحصور ذو النفاثتين (CIJ) الذي يظهر صورة لخلاط شفاف وإعداد خلاط Delrin مجمع يستخدم بانتظام في المختبر. (ب) خلاط دوامة متعدد المدخل صغير رباعي النفاثات (μMIVM) يظهر صورة لخلاط شفاف وإعداد خلاط من الفولاذ المقاوم للصدأ و Delrin مجمع. تم نقل تدفقات مدخل الخلاط الشفاف إلى جوانب الخلاط للحصول على تصور أفضل لهندسة الخلط ، بينما في الخلاط العملي ، تدخل تيارات المدخل من الأعلى. يعمل كل من CIJ و μMIVM بسرعة سائلة كافية بحيث تكون التدفقات في النظام المضطرب ، وينتج الخلط مقاييس Kolmogorov المجهرية أصغر من 1 ميكرومتر ، مما يتيح تحقيق التشبع الفائق في ~ 1.5 مللي ثانية. (ج) يستخدم إعداد خلط الماصة على نطاق واسع لإعداد كميات صغيرة من مشتتات LNP عن طريق خلط المحاليل المائية والإيثانولية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: عرض موسع ل μMIVM وحامل الخلط الخاص به. (أ) مجمع μMIVM ، مع محاقن زجاجية ، أسفل حامل الخلاط الذي يسهل الاكتئاب المتساوي والسريع للمحاقن. وهذا الرقم مستنسخ من ماركوالتر وآخرين.29. (ب) تفكيك μMIVM يظهر المكونات الداخلية. تتطابق هندسة الخلط هذه مع الخلاط الشفاف في الشكل 1B ، باستثناء أن تيارات المدخل تدخل من خلال القرص العلوي وليس من خلال السطح الأسطواني الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تؤدي زيادة عدد رينولدز في خلاط مضطرب إلى تقليل القطر الهيدروديناميكي LNP حتى رقم رينولدز الحرج للهضبة. (أ) تصوير تخطيطي لمضخة المحقنة وإعداد μMIVM المستخدم للتحكم في رقم رينولدز في الخلاط المضطرب عن طريق ضبط معدلات التدفق الحجمي للتيار . (ب) قطر LNP الهيدروديناميكي مقابل رقم رينولدز في MIVM. تؤدي زيادة عدد رينولدز وتبديد الطاقة المضطربة إلى تحسين الخلط وتؤدي إلى خلط أكثر تجانسا وتشبعا فائقا ونمو الجسيمات. فوق رقم رينولدز الحرج ، تظل أحجام LNP ثابتة مع زيادة معدلات التدفق بسبب حالة Da<<1 ، أي أن وقت انتشار المذيبات / مضادات المذيبات أقصر من وقت تجميع NP. معدلات التدفق المعطاة هي معدلات التدفق الإجمالية لجميع التيارات الأربعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: الخواص الغروية لل LNPs المنتجة مع الليبيدات المؤينة المختلفة. (أ) الأقطار الهيدروديناميكية وإمكانات زيتا لل LNPs المنتجة مع اثنين من الليبيدات المؤينة المختلفة: ALC-0315 و MC3. يتم إجراء القياسات عند درجة الحموضة 5 في حمام التبريد بعد تكوين LNP. تؤثر الاختلافات في pKa الظاهري للدهون المؤينة على الخصائص الغروية ل LNPs. (ب) قياسات كفاءة التغليف لكل من LNPs (n = 3 ، تمثل أشرطة الخطأ انحرافا معياريا واحدا). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: الخواص الغروية ل LNPs المنتجة باستخدام خلاطات مختلفة تغلف luciferase mRNA باستخدام MC3 للدهون المؤينة. (أ) الأقطار الهيدروديناميكية ل LNPs المنتجة بخلاطات 2 نفاثة و 4 نفاثة وماصة. يتم إجراء القياسات في ظل الظروف الحمضية لحمام التبريد بعد تكوين LNP (الجانب الأيسر) وبعد غسيل الكلى في مخزن مؤقت HEPES محايد (الجانب الأيمن). ينمو حجم LNP أثناء تحييد الأس الهيدروجيني بسبب إزالة الأيونات من الدهون المؤينة ، مما يؤدي إلى اندماج LNP ونموه. يوقف مثبت الدهون PEG نمو اندماج الجسيمات هذا قبل تكوين رواسب بحجم ميكرون. (ب) قياسات الشحنة السطحية (مثل ζ المحتملة) على LNPs المعزولة في حالة 10 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4. تقع جميع LNPs في حدود 2 mV من 0 mV ، مما يشير إلى أن أسطح الجسيمات هذه محايدة ولديها فقط كمية لا يمكن اكتشافها تقريبا من الشحنة الكاتيونية. (ج) قياسات كفاءة التغليف بعد غسيل الكلى ل LNPs (n = 3 ، تمثل أشرطة الخطأ انحرافا معياريا واحدا). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: نقل خلايا هيلا باستخدام LNPs المحضرة. أ: تلألؤ إنزيم اللوسيفيراز المسحوب بعد العلاج باللوسيفرين. (ب) صلاحية خلايا هيلا بعد الحضانة مع LNPs. لا تظهر الخلايا أي تغيير ذي دلالة إحصائية في الصلاحية ، كما هو موضح في مقايسة التمثيل الغذائي resazurin (n = 4 ، تمثل أشرطة الخطأ انحرافا معياريا واحدا). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تيار (ق) /حمام إخماد مكون صياغه رصيد حجم حقنة 1 -تيار الإيثانول(6 ملغ / مل من الدهون الكلية) الدهون المؤينة (MC3) 50 مول ٪ 50 ملغ/مل 0.5 مل زويتيريون ليبيد (DSPC) 10 مول ٪ 5 ملغ/مل كولسترول 38.5 مول٪ 5 ملغ/مل الدهون pegylated (DMG-PEG2000) 1.5 مول ٪ 4 ملغ/مل حقنة 2 -تيار مائي(0.3 ملغ / مل الحمض النووي الريبي) الخميرة الحمض النووي الريبي غير متوفر 6 10 ملغم/مل 0.5 مل خلات عازلة 20 ملليمول، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 حمام إخماد خلات عازلة 10 مللي مول ، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 4 مل الجدول 1: تركيبة باتيسيران LNP القياسية التي تنتجها خلاط CIJ. يستخدم الحمض النووي الريبي الخميرة كنموذج RNA لهذا البروتوكول. يتم إذابة جميع المحاليل جزيئيا وخلطها جيدا قبل تحميلها في المحاقن. تيار (ق) /حمام إخماد مكون صياغه رصيد حجم حقنة 1 -تيار الإيثانول(6 ملغ / مل من الدهون الكلية) الدهون المؤينة (MC3) 50 مول ٪ 50 ملغ/مل 0.5 مل زويتيريون ليبيد (DSPC) 10 مول ٪ 5 ملغ/مل كولسترول 38.5 مول٪ 5 ملغ/مل الدهون pegylated (DMG-PEG2000) 1.5 مول ٪ 4 ملغ/مل حقنة 2 -تيار مائي(0.3 ملغ / مل الحمض النووي الريبي) الخميرة الحمض النووي الريبي غير متوفر 6 10 ملغم/مل 0.5 مل خلات عازلة 20 ملليمول، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 حقنة 3 -تيار الإيثانول(6 ملغ / مل من الدهون الكلية) الدهون المؤينة (MC3) 50 مول ٪ 50 ملغ/مل 0.5 مل زويتيريون ليبيد (DSPC) 10 مول ٪ 5 ملغ/مل كولسترول 38.5 مول٪ 5 ملغ/مل الدهون pegylated (DMG-PEG2000) 1.5 مول ٪ 4 ملغ/مل حقنة 4 -تيار مائي(0.3 ملغ / مل الحمض النووي الريبي) الخميرة الحمض النووي الريبي غير متوفر 6 10 ملغم/مل 0.5 مل خلات عازلة 20 ملليمول، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 حمام إخماد خلات عازلة 10 مللي مول ، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 8 مل الجدول 2: تركيبة باتيسيران LNP القياسية التي تنتجها خلاط MIVM. يستخدم خلاط MIVM أربعة تيارات – اثنان من المذيبات واثنان من مضادات المذيبات. يمكن استخدام تيارات ذات لحظات غير متكافئة ؛ ومع ذلك ، يتم اختيار التدفقات ذات الزخم المتساوي لهذا البروتوكول. تيار (ق) /حمام إخماد مكون صياغه رصيد حجم حقنة 1 -تيار الإيثانول(6 ملغ / مل من الدهون الكلية) الدهون المؤينة (MC3) 50 مول ٪ 50 ملغ/مل 20 مل زويتيريون ليبيد (DSPC) 10 مول ٪ 5 ملغ/مل كولسترول 38.5 مول٪ 5 ملغ/مل الدهون pegylated (DMG-PEG2000) 1.5 مول ٪ 4 ملغ/مل حقنة 2 -تيار مائي(0.3 ملغ / مل الحمض النووي الريبي) الخميرة الحمض النووي الريبي غير متوفر 6 10 ملغم/مل 20 مل خلات عازلة 20 ملليمول، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 حقنة 3 -تيار الإيثانول(6 ملغ / مل من الدهون الكلية) الدهون المؤينة (MC3) 50 مول ٪ 50 ملغ/مل 20 مل زويتيريون ليبيد (DSPC) 10 مول ٪ 5 ملغ/مل كولسترول 38.5 مول٪ 5 ملغ/مل الدهون pegylated (DMG-PEG2000) 1.5 مول ٪ 4 ملغ/مل حقنة 4 -تيار مائي(0.3 ملغ / مل الحمض النووي الريبي) الخميرة الحمض النووي الريبي غير متوفر 6 10 ملغم/مل 20 مل خلات عازلة 20 ملليمول، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 حمام إخماد(وقت التحصيل= 30 ثانية) هيبس العازلة 10 مليمول، درجة الحموضة 7.5 1 م ، درجة الحموضة 7.5 320 مل الجدول 3: تركيبة LNP التي ينتجها خلاط MIVM مدفوع بمضخة حقنة. يستخدم DODMA كدهون مؤينة جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي الخميرة كنموذج RNA. يتم اختيار مثال تشغيل مع 40 مل / دقيقة لهذا البروتوكول. تيار (ق) /حمام إخماد مكون صياغه رصيد حجم حقنة 1 -تيار الإيثانول(12 ملغ / مل من الدهون الكلية) الدهون المؤينة (MC3 أو ALC0315) 50 مول ٪ 50 ملغ/مل 0.5 مل زويتيريون ليبيد (DSPC) 10 مول ٪ 5 ملغ/مل كولسترول 38.5 مول٪ 5 ملغ/مل الدهون pegylated (DMG-PEG2000) 1.5 مول ٪ 4 ملغ/مل حقنة 2 -تيار مائي(0.6 مجم / مل من الحمض النووي الريبي) الخميرة الحمض النووي الريبي غير متوفر 6 10 ملغم/مل 0.5 مل خلات عازلة 20 ملليمول، درجة الحموضة 5 100 مليمول، درجة الحموضة 5 حمام إخماد خلات عازلة 10 مليمول، درجة الحموضة 5 100 مليمول، درجة الحموضة 5 9 مل الجدول 4: تركيبات LNP من اثنين من الدهون المؤينة المختلفة التي ينتجها خلاط CIJ. تصنع التركيبات إما من ALC-0315 أو MC3 ، بينما يتم الاحتفاظ بجميع المكونات الأخرى كما هي. تيار (ق) /حمام إخماد مكون صياغه رصيد حجم حقنة 1 -تيار الإيثانول(6 ملغ / مل من الدهون الكلية) الدهون المؤينة (MC3) 50 مول ٪ 50 ملغ/مل 0.5 مل زويتيريون ليبيد (DSPC) 10 مول ٪ 5 ملغ/مل كولسترول 38.5 مول٪ 5 ملغ/مل الدهون pegylated (DMG-PEG2000) 1.5 مول ٪ 4 ملغ/مل حقنة 2 -تيار مائي(0.3 ملغ / مل الحمض النووي الريبي) فلحمض الرنا المرسال غير متوفر 6 1 ملغ/مل 0.5 مل خلات عازلة 20 ملليمول، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 حمام إخماد خلات عازلة 10 مللي مول ، درجة الحموضة 4 100 مليمول، درجة الحموضة 4 4 مل الجدول 5: تركيبة باتيسيران LNP القياسية التي تنتجها خلاط CIJ. يستخدم فيستخدم الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الذي يعبر عن بروتين لوسيفيراز لقياس التعبير الجيني باستخدام مقايسة التلألؤ الحيوي. الملف التكميلي 1: موردو خلاطات CIJ و MIVM. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تم تقديم توليف LNPs المحتوية على بوليمرات الحمض النووي باستخدام خلاطين مضطربين محصورين. عند إجراؤها بسرعات مناسبة ، تضمن الخلاطات المضطربة CIJ أن النطاق الزمني للخلط أقصر من وقت تجميع LNP ، مما ينتج عنه ظروف تشبع فائق متجانسة لتشكيل LNPs صغيرة ذات توزيعات ضيقة^{الحجم 21}. وبالتالي ، فإن LNPs المصنوعة من نفس الكيمياء باستخدام أشكال هندسية مختلفة للخلاط المضطرب (2-jet CIJ وخلاط MIVM 4-jet) تظهر خصائص فيزيائية كيميائية مماثلة وتظهر كفاءات نقل جيدة (الشكل 5 والشكل 6). في المقابل ، ينتج عن LNPs المصنوعة باستخدام الماصة التي تنتج خلطا أقل كثافة في LNPs أكبر وأكثر تشتتا (الشكل 5 أ) مع كفاءة نقل أقل. من المفهوم منذ فترة طويلة أن حركية الخلط والتجميع تلعب دورا مهما في معالجة LNP ؛ لاحظ كوليس وآخرون أن الخلط السريع للحمل الحراري المنتشر للإيثانول والمخزن المؤقت يؤدي إلى تكوين جزيئات صغيرة ذات توزيع ضيق الحجم ، في حين أن الخلط المنتشر البطيء يؤدي إلى جزيئات أكبر ذات توزيعات واسعة الحجم⁹. ينخفض النطاق الزمني للخلط في الخلاطات المضطربة CIJ بشكل متناسب مع معدلات تدفق مدخل التيارات إلى الخلاط²⁷. يتم قياس ذلك كميا بواسطة رقم رينولدز عديم الأبعاد (Re) ، والذي يقيس النسبة بين قوى القصور الذاتي واللزجة. يحدث الاضطراب داخل غرف الخلط في CIJ و MIVM عند Re عالية بما فيه الكفاية ، بحيث يؤدي تمدد الدوامة المضطربة إلى مقاييس صغيرة من الطول تنتج خلطا سريعا للمذيبات / مضادات المذيبات عن طريق الانتشار. يعتمد مقياس الطول المضطرب على Re وليس على الهندسة المحددة لجهاز الخلط. هذا هو السبب في أن CIJ أو MIVM يصنعان نفس جزيئات LNP ، ولماذا تصنع الأحجام المختلفة لخلاطات MIVM نفس أحجام NP²⁷. عند Re العالية ، المقابلة لسرعات المدخل العالية ، يمكن إجراء LNPs بشكل متكرر دون اختلافات من دفعة إلى أخرى (الشكل 3B).

يتيح هذا البروتوكول صياغة مجموعة متنوعة من mRNA أو DNA أو siRNA LNPs بخصائص فيزيائية كيميائية مختلفة باستخدام خلاطات CIJ المضطربة. بالإضافة إلى السماح بتعدد الاستخدامات في التركيب والتركيزات ، توفر هذه التقنية مسارا واضحا لفحص التركيبات بسرعة عند بيع مقاعد البدلاء (بضعة ملليغرامات) وتوسيع نطاق تركيبات الرصاص إلى أحجام دفعات صناعية أكبر بمعدلات إنتاج تبلغ 5 لتر / دقيقة³⁶. كانت هذه عقبة رئيسية أمام العديد من التقنيات الأخرى ، بما في ذلك الخلط السائب والموائع الدقيقة. على سبيل المثال ، تفشل تقنيات المعالجة السائبة في تصنيع LNPs بشكل متكرر باستمرار ، حتى على مقاييس قليلة ملليلتر. توفر تقنيات الموائع الدقيقة تحسنا كبيرا على تقنيات الخلط السائب لتمكين إنتاج LNPs موحدة وقابلة للتكرار. ومع ذلك ، فهي فقط في نطاق مليغرام²⁹. كما هو مفصل في المقدمة ، يوفر توازي أجهزة الموائع الدقيقة محاولة للتوسع إلى موازين الإنتاج ولكنه لا يلغي مشكلة القاذورات ، ولا يمكن تحجيمها بنجاح مثل الخلاطات القائمة على تقنية النفاثة المحصورة.

بصرف النظر عن هذه المزايا ، ستكون خلاطات CIJ مفيدة في تصنيع الجيل التالي من LNPs التي تظهر قدرات الاستهداف أو إجراء تحرير الجينات. تحتوي تركيبات LNP الحالية على دهون وأحماض نووية لها انتشارات متشابهة ، وبالتالي ، يمكن صنعها حتى مع خلط ضعيف قليلا على نطاق مقاعد البدلاء. ومع ذلك ، قد تتطلب مناهج تحرير الجينات تغليف أنواع الحمض النووي بأوزان جزيئية مختلفة على نطاق واسع ، مثل جزيئات الحمض النووي الريبي الإرشادية الصغيرة ونسخ mRNA الكبيرة ، لترميز بروتين CAS9³⁷. إن المقاييس الزمنية المختلفة جدا للانتشار لهذه الأنواع المختلفة تجعل التغليف المنتظم بنسب متكافئة أمرا صعبا. تصبح مشكلة التغليف الموحد أكثر وضوحا عندما تصبح كفاءة الخلط أكثر فقرا. وبالمثل ، قد يحتاج استهداف الخلايا غير الكبدية إلى دمج مثبتات بطيئة الانتشار مرتبطة بقوة (مثل البوليمرات المشتركة ذات الوزن الجزيئي الكبير مع روابط الاستهداف). يمكن اقتران روابط مستهدفة بحجم 14 كيلو دالتون لمنع البوليمرات المشتركة قبل تجميع الجسيمات النانوية ، مما يتيح دمجها بشكل موحد في NPs باستخدام خلط CIJ³⁸. الخلاطات المضطربة CIJ هي أدوات مفيدة لتصنيع LNPs المصنوعة من مكونات لها انتشار مختلف.

بينما تظهر الخلاطات المضطربة CIJ العديد من المزايا على الخلاطات الأخرى لصياغة LNPs ، من المهم ملاحظة القيود المرتبطة بكل هندسة. يتطلب خلاط CIJ 2-jet أن يكون لكل من تيارات المدخل (الإيثانول والماء) لحظات متساوية (في حدود 10٪ -30٪) لتحقيق خلط دقيق مضطرب موحد في الغرفة. حقيقة أن تيار الخروج يتكون من 50:50 مذيب / مضاد للمذيب يحد من مستوى التشبع الفائق في تجويف الخلط حيث يحدث هطول الأمطار²⁹. تتم معالجة هذا العيب بواسطة خلاط MIVM ذو 4 نفاثات ، حيث يمكنه استخدام أربع نفاثات ذات لحظات غير متكافئة لتحقيق ظروف التشبع الفائق العالية في غرفة الخلط. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون كلا الخلاطين في حدود ملليغرام من الكتلة الكلية ، مما يجعلهما خيارا غير مثالي للفحص عالي الإنتاجية للعديد من تركيبات LNP المختلفة. بالنسبة لتركيبات LNP البسيطة ، قد يكون من الأفضل إجراء الفحص باستخدام الموائع الدقيقة أو استراتيجيات السحب على مقاييس ميكروغرام ثم نقلها إلى تقنية النفاثة المحصورة عند تحديد عدد قليل من تركيبات الرصاص. من المهم أيضا مراعاة الأحجام الميتة في الخلاطات. في CIJ ، خلاطان نفاثان ، تكون أحجام الانتظار 50-100 ميكرولتر. يجب طرح هذه الكمية من المواد من الكمية التي تم التقاطها في حمام التبريد عند حساب الاسترداد من العملية. هذه الخسائر ضئيلة عند التشغيل على نطاقات كبيرة ولكنها ستشكل خسائر بنسبة 10٪ عندما يتم إنتاج أحجام إجمالية تبلغ 5 مل ، كما هو موضح هنا. تعد الخلاطات المضطربة النفاثة الاصطدامية أداة قيمة لإنتاج LNPs على نطاق GMP ، كما يتضح من لقاحي COVID-19 المعتمدين من إدارة الغذاء والدواء.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

زمالة NSF إلى BKW (DGA1148900) ، ودعم من Tessera Therapeutics Inc. ، ومؤسسة Bill and Melinda Gates (BMGF ، أرقام العقود OPP1150755 و INV-041182) ، وإدارة الغذاء والدواء بموجب الجائزة 75F40122C00186.

Materials

18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Helper lipid
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305167
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165306
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Polar Lipids	890900	Ionizable lipid
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mL	Millipore Sigma	UFC910024
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2620
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)	Trilink Biotechnologies	L-7202
Confined Impinging Jets Mixer	Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Ionizable lipid
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Polar Lipids	880151P	PEG-lipid
DODMA	Avanti Polar Lipids	890899P	Ionizable lipid
Ethanol 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Fetal Bovine Serum, certified, United States	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, free acid	IBI Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 ETFE tubing ” OD 0.093” ID	Idex Health & Science	1648
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fitting	Idex Health & Science	P-678
Idex P-940 ferrule for ETFE tubing	Idex Health & Science	P-940
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers
Mixer stand	Holland Applied Technologies	N/A	See Markwalter & Prud'homme for design.²⁶ Contact Holland for Purchase
Multi-Inlet Vortex Mixer	Holland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation
O-ring (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Outlet ferrule – CIJ	Idex Health & Science	P-200	Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet fitting – CIJ	Idex Health & Science	P-205	Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet fitting – MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combination with ferrule
Outlet tubing – CIJ	Idex Health & Science	1517	Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber
Outlet tubing – MIVM	N/A	N/A	Fit to ferrule ID.
PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	N/A
Plastic two-piece syringe 1 mL	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Plug fitting	Idex Health & Science	P-309	Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurin, Sodium Salt	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Scintillation vial	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mL	SGE	100MR-LL-GT
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mL	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Sodium Acetate	Millipore Sigma	32319-500G-R
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S320-500
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-1KG
Syringe Filters, Sterile	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Water, Endotoxin Free	Quality Biological	118-325-131	RNAse and DNAse free
Yeast RNA (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM7118

References

Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -. S., Jadhav, S. G. Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape. Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).
Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery. Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).
Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery. ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).
Semple, S. C., et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol. 28 (2), 172-176 (2010).
Lam, K., et al. Unsaturated, trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), 2209624 (2023).
Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).
Jürgens, D. C., et al. Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques – an evaluation of particle properties and efficiency. OpenNano. 12, 100161 (2023).
Wang, X., et al. Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery. Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).
Yanez Arteta, M., et al. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).
Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).
Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).
Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems. J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).
Prakash, G., et al. Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids. Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197 (2022).
Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application. Pharmaceutics. 14 (1), 141 (2022).
Webb, C., et al. Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes. Int J Pharm. 582, 119266 (2020).
Warne, N., et al. Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021. Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer. Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).
Hogarth, C., et al. Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles. J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).
Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37 (2012).
D’addio, S. M., Prud’homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Phys Rev Lett. 91 (11), 118302 (2003).
Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).
Markwalter, C. E., Prud’homme, R. K. Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE J. 49, 2264-2282 (2003).
Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud’homme, R. K. Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles. J Vis Exp. (143), e58757 (2019).
Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform. J Vis Exp. 168, e62226 (2021).
Bizmark, N., et al. Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers. Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083 (2024).
Zhang, C., et al. Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy. Molecules. 27 (6), 1943 (2022).
Kulkarni, J. A., et al. Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads. Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).
El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing. J Vis Exp. (191), e64810 (2023).
Scalzo, S., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes. Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).
Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud’homme, R. K. Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale. J Transl Med. 17 (1), 200 (2019).
Kazemian, P., et al. Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components. Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).
Pinkerton, N. M. . Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. , (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Subraveti, S. N., Wilson, B. K., Bizmark, N., Liu, J., Prud’homme, R. K. Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers. J. Vis. Exp. (210), e67047, doi:10.3791/67047 (2024).