Summary

Livraison de nanoparticules d’une charge utile d’oligonucléotide dans un modèle animal de glioblastome multiforme

Published: September 27, 2024
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Summary

La barrière hémato-encéphalique est un obstacle important à l’administration de traitements pour le glioblastome, une maladie pour laquelle il n’existe aucun remède. Ici, nous rapportons une nanoplateforme thérapeutique d’oxyde de fer guidée par l’image in vivo qui peut contourner cette barrière physiologique en raison de sa taille et s’accumuler dans la tumeur.

Abstract

Le glioblastome multiforme (GBM) est la forme la plus courante et la plus agressive de malignité cérébrale primitive pour laquelle il n’existe aucun remède. La barrière hémato-encéphalique est un obstacle important dans l’administration de thérapies contre le GBM. Il s’agit d’une nano-plateforme d’administration thérapeutique à base d’oxyde de fer, guidée par l’image, capable de contourner cette barrière physiologique en raison de sa taille et de s’accumuler dans la région tumorale, délivrant ainsi sa charge utile. Cette nanoplateforme de 25 nm se compose de nanoparticules d’oxyde de fer recouvertes de dextran réticulé marquées avec un colorant fluorescent Cy5.5 et contenant un oligonucléotide antisens comme charge utile. Le noyau magnétique d’oxyde de fer permet le suivi des nanoparticules par imagerie par résonance magnétique in vivo , tandis que le colorant Cy5.5 permet le suivi par imagerie optique. Ce rapport détaille le suivi de l’accumulation de cette plateforme de nanoparticules (appelée MN-anti-miR10b) dans les tumeurs de glioblastome implantées orthotopiquement après injection intraveineuse. De plus, il donne un aperçu de l’administration in vivo d’oligonucléotides d’ARN, un problème qui a entravé la traduction des thérapies à ARN en clinique.

Introduction

Le glioblastome multiforme (GBM) est le grade le plus élevé d’astrocytome pour lequel il n’existe pratiquement aucun remède. Environ 15 000 personnes reçoivent un diagnostic de glioblastome chaque année, ce qui a une survie médiane lamentable d’environ 15 mois et un taux de survie à 5 ans de 5 %1. Au cours des dernières décennies, il y a eu une amélioration marginale du pronostic malgré les multiples efforts déployés pour faire progresser les options thérapeutiques. La norme de soins actuelle pour le GBM comprend une résection chirurgicale maximale, lorsque cela est possible, suivie d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie2. Le témozolomide (TMZ), la chimiothérapie de choix, a été le dernier traitement du glioblastome dont l’efficacité clinique a été démontrée. cependant, au moins 50% des tumeurs GBM présentent une résistance au TMZ3. Malgré ce régime thérapeutique rigoureux, il existe toujours un besoin clinique important d’améliorer le traitement du glioblastome.

Le développement de traitements pour le GBM et d’autres maladies liées au cerveau est considérablement entravé par la nature sélective de la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est une barrière physiologique composée de cellules endothéliales, de péricytes et d’extrémités des pieds astrocytaires, qui crée la membrane semi-perméable entre le système circulatoire et le cerveau, limitant le libre passage des molécules et des cellules dans le cerveau4. Bien qu’elle soit protectrice dans la physiologie normale et essentielle pour l’homéostasie cérébrale, la BHE empêche de nombreux traitements d’atteindre le cerveau, ce qui complique le traitement du GBM. Les efforts visant à améliorer l’administration de produits thérapeutiques contre le GBM ont conduit à la mise au point de véhicules d’administration à base de nanoparticules, à l’amélioration de l’administration de médicaments par ultrasons ciblés et à l’administration de médicaments médiée par les récepteurs 5,6.

Les nanoparticules sont devenues un moyen prometteur pour développer des traitements pour une myriade de maladies, y compris les cancers. L’application de nanoparticules à des fins d’imagerie et thérapeutiques dans le GBM a été tentée à l’aide de diverses constructions de nanoparticules 7,8. En mettant l’accent sur l’administration de médicaments au GBM en conjonction avec l’imagerie in vivo de l’administration, l’approche proposée utilise des nanoparticules magnétiques (MN) constituées d’un noyau d’oxyde de fer et recouvertes de dextran pour la stabilité. Les propriétés magnétiques de ces nanoparticules permettent leur détection par imagerie par résonance magnétique (IRM), tandis que la chimie de conjugaison simple au revêtement de dextran aminé permet la conjugaison de fractions thérapeutiques telles que des molécules d’ARN, des fractions de ciblage supplémentaires ou des fractions d’imagerie (telles que le colorant optique proche infrarouge Cy5.5)9,10. En plus des capacités d’imagerie, la nanoplateforme est capable de prolonger la demi-vie des thérapies à base d’ARN en protégeant l’oligonucléotide des nucléases endogènes, améliorant ainsi l’administration thérapeutique. Ici, l’application de cette nanoplateforme pour l’administration in vivo d’oligonucléotides thérapeutiques (appelés MN-anti-miR10b) au GBM, suivis par imagerie in vivo, est présentée. Auparavant, la capacité de cette nanoplateforme à s’accumuler a été démontrée dans les cellules GBM in vitro, entraînant une perte significative de viabilité des cellules tumorales11. Avant de réaliser des études thérapeutiques in vivo, il est nécessaire de démontrer l’administration in vivo de cette nanoplateforme aux tumeurs GBM dans des modèles animaux. Pour ce faire, des modèles animaux de GBM orthotopique ont été produits, et l’administration intraveineuse du concept a été effectuée, suivie d’une imagerie in vivo. Voici les protocoles de ces études montrant une accumulation dans la région tumorale confirmée par l’imagerie in vivo et la microscopie ex vivo.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan (IACUC). Des souris nues athymiques femelles consanguines ont été achetées chez Jackson Labs (souche #007850) à l’âge de 7 semaines et laissées s’acclimater pendant 1 semaine avant la chirurgie d’implantation. Les souris pesaient environ 21 à 25 g au moment de l’implantation. Des cellu…

Representative Results

MN-anti-miR10b a été synthétisé et caractérisé, comme décrit précédemment11. La microscopie électronique à transmission de MN-anti-miR10b montre la morphologie et la polydispersité de la nanoplateforme (Figure 1B). Cette nano-plate-forme a une taille moyenne de 25,12 ± 0,34 nm avec un potentiel zêta de 13,18 ± 1,47 mV (Figure 1C,D). Dans ces études, des so…

Discussion

Plusieurs étapes critiques à travers les différentes méthodes de validation de l’accumulation des nanoparticules à travers la BHE peuvent être décisives pour le succès du protocole. En commençant par l’implantation orthotopique de cellules GBM, il est important de s’assurer que les lignes de suture du crâne sont visibles après séchage de l’os ; Cela aide au placement précis des cellules tumorales. Pour percer le crâne, il est préférable d’appliquer une légère …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le financement de cette étude a été fourni en partie par la subvention de l’Alliance des sciences de la santé de l’Université d’État du Michigan Henry Ford Health Systems à A.M. et A.dC. Nous remercions la Dre Danielle R. Ferguson d’avoir supervisé les études sur les animaux à l’Université d’État du Michigan et d’avoir approuvé cette vidéo.

Materials

Athymic nude "J:NU" mice Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:007850 Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin Gibco 25200-056 Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube DOT Scientific RN1700-GMT For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4 Hamilton 65460-06 Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond 3M 1469SB Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde  Thermo Scientific J199943-K2 Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe Cardinal MW-APL Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa Leica For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub Purdue 6761815101 Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30 Bruker Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax Medline DYNJBW25 Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill F.S.T. 19007-05 Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20 Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065 Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps F.S.T. 11150-10 Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum Corning 35-010-CV Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors – Sharp 10.5cm F.S.T. 14060-10 Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine) Sagent 673-76 Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill CellPoint Scientific 67-1200A Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2" Becton, Dickinson 324704 Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane Covetrus 11695067772 Anethesia
Isoflurane vaporizer SOMNI Scientific VS6002 Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System PerkinElmer/Revvity 128201 Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt PerkinElmer/Revvity 122799-100MG Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine) Zoetis 10004027 Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen) Zoetis 10004031 Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950 Leica CM1950 For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS Gibco 14190-144 Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment MWI Veterinary 27505 Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler F.S.T. 18000-30 Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm Sakura 4566 Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583 Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human Millapore Sigma 9063001 Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml Covetrus 1XYL006 Paralytic for tumor implantation surgery

References

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Citer Cet Article
Kim, B. D., Mondal, S. K., Kenyon, E., Chen, M., Mallett, C. L., deCarvalho, A. C., Medarova, Z., Moore, A. Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model. J. Vis. Exp. (211), e66986, doi:10.3791/66986 (2024).

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