Le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud a approuvé tous les soins, l’entretien et le traitement des animaux. Du tissu intestinal a été prélevé sur des souris adultes C57BL/6J (mâles et femelles âgés de 3 à 5 mois, pesant environ 30 g) pour être utilisé dans la présente étude. 1. Fixation du tissu intestinal Disséquez soigneusement tout l’intestin d’une souris euthanasiée et placez-le dans un bateau de pesée ou une boîte de Pétri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirez les intestins du PBS et utilisez des ciseaux pour éliminer délicatement l’excès de graisse et de tissu conjonctif. La coupe du tissu conjonctif aide le tissu à rester à plat lors des étapes suivantes. Divisez l’intestin en segments individuels à l’aide de ciseaux (c’est-à-dire duodénum, jéjunum, iléon, caecum et côlon). Divisez les segments en fonction des caractéristiques anatomiques et/ou de la longueur, avec environ 13 % de la longueur intestinale étant le duodénum, 58 % étant le jéjunum, 8 % étant l’iléon, 6 % étant le cæcum et le côlon est de 15 %9. Le duodénum suit l’estomac et l’iléon est la section terminale de l’intestin grêle immédiatement avant le caïcum. Libérez le côlon en coupant l’endroit où il rejoint le caecum à l’aide de ciseaux. Placez le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon dans le bateau de pesée ou la boîte de Pétri de PBS. Jetez le caecum ou fixez-le selon d’autres méthodes publiées10. Fixez une pointe de pipette P200 à une seringue de 10 ml en coupant la grande extrémité de la pointe avec une lame de rasoir. Remplissez la seringue de PBS. Insérez l’embout de la seringue dans l’ouverture d’un segment intestinal à l’aide d’une pince. Utilisez la pince pour maintenir le segment intestinal sur la seringue et rincez doucement à un débit de ~50 μL/s pour éliminer le contenu intestinal. Recueillez le contenu intestinal dans un bateau de pesée vide ou une boîte de Pétri. Posez le segment intestinal humide en ligne droite sur une bande de papier filtre cellulosique étiqueté à sec (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que le segment intestinal est suffisamment humide pour bien adhérer au papier filtre sec. Étiquetez le papier filtre avec les informations sur le numéro de souris, le génotype, le groupe expérimental, etc. à l’aide d’un crayon.REMARQUE : L’utilisation d’un stylo pour étiqueter le papier filtre peut entraîner la perte d’étiquettes lors de la fixation. À l’aide de ciseaux de dissection, ouvrez l’intestin longitudinalement le long de la ligne mésentérique. Coupez ~5 mm à la fois, à l’aide du bord inférieur des ciseaux ou d’une paire de pinces pour poser le tissu coupé à plat sur le papier filtre. Continuez jusqu’à ce que toute la section de l’intestin soit coupée et posée à plat sur le papier filtre. Prenez soin d’ouvrir l’intestin en une ligne aussi droite que possible, car cela facilitera le roulement du tissu.REMARQUE : Des ciseaux à pointe sphérique peuvent être utilisés pendant cette étape pour éviter d’endommager les tissus. Placez un autre morceau de papier filtre sur le segment intestinal. Assurez-vous que le papier filtre prend en sandwich le segment intestinal, empêchant l’intestin de s’enrouler ou de perdre sa forme aplatie pendant la fixation. Agrafez les bords du papier filtre pour fixer le mouchoir en place. N’agrafez pas le tissu. Placez suffisamment d’agrafes autour du mouchoir pour éviter que le mouchoir ne se détache du papier filtre pendant la fixation. Répétez les étapes 1.5 à 1.10 pour chacun des segments intestinaux (duodénum, jéjunum, iléon et côlon). Immergez les tissus dans du formol tamponné normal à 10 % (ou un fixateur de votre choix tel que le paraformaldéhyde à 4 %, le fixateur de Carnoy, etc.) pendant la nuit à 4 °C.ATTENTION : Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle approprié, car les fixateurs tels que le formol sont toxiques. 2. Roulement et traitement des tissus intestinaux ATTENTION : Effectuez les étapes 2.1-2.6 dans une hotte ventilée. Retirez délicatement le morceau supérieur de papier filtre (celui qui touche le côté luminal de l’intestin). À l’aide d’une pince, décollez soigneusement l’intestin de la partie inférieure du papier filtre. Jetez le papier filtre. Remplissez trois bateaux de pesée avec du PBS. Lavez le mouchoir en PBS 3x pour éliminer le formol du tissu. À l’aide d’une pince à action inverse (voir le tableau des matériaux), prélevez un morceau d’intestin le long du bord court avec le côté luminal vers le haut. Tournez la pince pour rouler le tissu. Utilisez une paire de pinces régulières pour aider à guider le tissu lorsqu’il est roulé. Si le mouchoir est plié, déroulez-le et réessayez. Placez le tissu dans un bateau de pesée sec ou une boîte de Pétri. Tenez le tissu en place avec une pince dans une main. Ouvrez soigneusement la pince à action inverse et relâchez le tissu, en utilisant l’autre pince pour déloger le tissu de la pince à action inverse. Insérez une goupille de dissection de taille 00 ou une goupille minutien dans le tissu (voir la table des matériaux). Utilisez des pinces coupantes pour retirer la pointe pointue de la goupille. Placez le mouchoir dans une grande cassette, puis placez la cassette dans un récipient contenant de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elle soit prête à être traitée. Répétez les étapes 2.1 à 2.5 avec tous les segments intestinaux (le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon), en plaçant les quatre rouleaux de tissu dans la même grande cassette (voir la table des matériaux). Assurez-vous que la cassette est étiquetée à l’aide d’un crayon pour éviter que l’étiquette ne se lave dans les solutions d’éthanol et de xylène (voir le tableau des matériaux). Une fois que tous les échantillons ont été roulés, placez-les dans un processeur de tissus. Utilisez les réglages suivants pour le tissu intestinal : éthanol à 70 % pendant 35 min ; 90% d’éthanol pendant 35 min ; 95% d’éthanol pendant 35 min ; 100% éthanol pendant 35 min, 3x ; xylène pendant 35 min, 3x ; paraffine pendant 60 min, 3x. Les cassettes peuvent être laissées dans de la cire de paraffine fondue pendant de longues périodes.ATTENTION : Assurez-vous de porter un équipement de protection approprié, car le xylène est un produit chimique toxique. 3. Intégration du tissu intestinal Préchauffez de grands moules d’enrobage pour maintenir la paraffine fondue. Retirez les cassettes du processeur de tissus et placez-les dans un bécher de paraffine fondue. À une station d’enrobage, placez une petite quantité de paraffine dans un moule. Retirez les quatre rouleaux suisses de la cassette et placez-les tous dans un seul moule, en les posant aussi à plat que possible. Ajoutez plus de paraffine pour remplir le moule. Déplacez le moule sur la plaque froide et assurez-vous que tous les rouleaux suisses sont à plat au fond du moule. Placez un petit couvercle de cassette étiqueté (voir tableau des matériaux) sur le moule et ajoutez plus de paraffine si nécessaire. Une fois la cire solidifiée, retirez le bloc du moule. Le tissu est maintenant prêt à être coupé en tranches de 5 μm et flotté sur des lames de verre chargées pour l’immunocoloration11. 4. Adhérence tissulaire et préparation des lames Pour s’assurer que la section de tissu de paraffine préparée de 5 μm adhère à la lame, chauffez les lames de verre sur un chauffe-lames ou un bloc chauffant réglé à 60 °C pendant 15 à 30 min. Les diapositives peuvent également être laissées chauffer plus longtemps ; Cette étape n’est pas urgente. Laisser refroidir les lames à température ambiante (~15 min). 5. Déparaffinisation Au début de la déparaffinisation des lames, assurez-vous que le tissu reste dans une solution et ne se dessèche pas pendant toute la durée de l’immunomarquage. Utilisez un support à lames (voir la Table des matières) pour tenir les lames de verre et placez-les dans un plat résistant aux solvants (voir la Table des matières) rempli d’un réactif de clarification/déparaffinisation (voir la Table des matières). Assurez-vous que le réactif recouvre complètement le tissu sur chaque lame. Avant d’immerger complètement les lames dans le réactif de clarification, trempez ou bousculez le support de lames plusieurs fois dans la solution de clarification. Laissez les lames immergées pendant 10 minutes ou plus.REMARQUE : Cette étape peut devoir être effectuée dans une hotte ventilée en raison de fumées dangereuses, selon l’agent de nettoyage choisi. La déparaffinisation du tissu dans cette étape n’est pas sensible au temps, si vous utilisez un agent de clarification non toxique. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès de réactif de clarification. Dans une nouvelle boîte résistante aux solvants, répétez l’étape 5.2. Dans une nouvelle parabole résistante aux solvants, répétez l’étape 5.3. Laissez les lames immergées pendant 15 minutes ou plus. Cette étape n’est pas urgente. 6. Réhydratation Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès de réactif de clarification. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli à 100 % d’éthanol, trempez ou bousculez la grille à glissières plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente. Répétez l’opération 2 fois. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès d’éthanol à 100 %. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’éthanol à 95 %, trempez ou bousculez la grille à glissières plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente. Répétez l’opération 1 fois. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès d’éthanol à 95 %. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’éthanol à 70 %, trempez ou bousculez la grille à glissières plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès d’éthanol à 70 %. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’éthanol à 50 %, trempez ou bousculez la grille à glissières plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès d’éthanol à 50 %. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’eau déminéralisée (DI), trempez ou bousculez la grille à lames plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente.Pour faire une pause ici, placez les lames dans un récipient avec du PBS jusqu’à ce que l’immunocoloration puisse être reprise après l’étape de réhydratation de l’eau de 5 minutes. 7. Récupération de l’antigène Remplissez une nouvelle boîte résistante aux solvants avec un tampon de récupération d’antigène approprié. Transférez directement le support de diapositives dans cette solution. Assurez-vous que les lames sont complètement immergées dans la solution de récupération de l’antigène, en recouvrant complètement le tissu.REMARQUE : Les solutions optimales de récupération d’antigène peuvent varier en fonction de l’anticorps utilisé. Il peut être nécessaire de déterminer la récupération de l’antigène nécessaire pour les anticorps individuels par le chercheur.Pour faire 1x tampon de récupération de l’antigène du citrate, ajoutez 2,94 g de citrate de sodium dihydraté (voir le tableau des matériaux) pour 1 L d’eau déminéralisée. Une fois le citrate de sodium dihydraté dissous, ajoutez du chlorure d’hydrogène (voir tableau des matériaux) jusqu’à ce que la solution atteigne un pH de 6. Enfin, ajoutez 500 μL de Tween20 (voir le tableau des matériaux) pour 1 L d’eau déminéralisée. Pour faire 1x tampon de récupération de l’antigène Tris-EDTA, ajoutez 1,211 g de base Tris et 0,292 g d’EDTA dans 1 L d’eau déminéralisée. Une fois dissous, ajustez à pH 9. Couvrez le plat résistant aux solvants contenant la solution de récupération d’antigène et les lames avec un couvercle et fixez le couvercle avec des élastiques. Placez le plat sécurisé résistant aux solvants dans un autocuiseur (voir le tableau des matériaux) sur la grille métallique ou le dessous de plat. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’eau dans l’autocuiseur pour atteindre la grille métallique ou le dessous de plat afin que la pression puisse s’accumuler. Placez le couvercle sur l’autocuiseur et tournez-le dans le sens des aiguilles d’une montre pour verrouiller le couvercle en place. Tournez la soupape de limite de pression qui se trouve sur le couvercle jusqu’au réglage de pression. Sous le réglage du menu, sélectionnez haute pression sur l’autocuiseur, puis sous le réglage de la durée, réglez l’autocuiseur sur 30 min. Sélectionnez Démarrer. Après 30 minutes, l’autocuiseur émettra un bip et se réglera automatiquement sur le réglage de maintien au chaud. Attendez que la pression se soit relâchée naturellement et que le couvercle se dévisse librement. Utilisez des gants résistants à la chaleur (voir le tableau des matériaux) pour retirer le plat résistant aux solvants de l’autocuiseur et retirez l’élastique et le couvercle. Placez le plat dans un bain de glace pendant ~30 min pour permettre aux lames de refroidir à température ambiante. Cette étape n’est pas urgente. Une fois refroidi à température ambiante, retirez la grille coulissante du plat résistant aux solvants et placez-la dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’eau DI pour éliminer la solution résiduelle de récupération d’antigène. Assurez-vous que les lames sont complètement immergées. Retirez la grille coulissante de l’eau DI et placez-la dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli de PBS pendant 5 min. Assurez-vous que les lames sont complètement immergées. Cette étape n’est pas urgente. 8. Blocage des taches de fond non spécifiques Préparez une chambre humidifiée en prenant une grande boîte à diapositives et en retirant le couvercle en carton collé au couvercle. À la base de la boîte à glissières, placez des serviettes en papier humides verticalement vers le bas. Assurez-vous que les serviettes en papier humides sont à plat. Retirez une diapositive une par une du support de diapositives immergé dans du PBS. Essuyez soigneusement l’excès de PBS sur la lame de verre, en évitant le tissu. Avec un stylo hydrophobe (voir Tableau des matériaux), formez une barrière qui entoure le tissu en dessinant une boîte autour du tissu avec le stylo hydrophobe. Veillez à éviter le mouchoir et à ne pas utiliser le stylo hydrophobe trop près du mouchoir. Placez la diapositive délimitée horizontalement sur les serviettes en papier humides. Ajouter un tampon de blocage pour couvrir le tissu (~100 μL).Pour fabriquer un tampon de blocage, ajoutez 100 μL de gélatine de peau de poisson d’eau froide (gélatine Teleostein ; voir le tableau des matières) à 9,85 mL de PBS. Enfin, ajoutez 50 μL de Triton X-100 à 20 % (voir le tableau des matériaux) et mélangez jusqu’à dissolution. Répétez les étapes 8.2 à 8.4 pour chaque diapositive. Fermez la chambre humidifiée et incubez les lames à température ambiante pendant 90 min. 9. Blocage souris sur souris Lorsque vous utilisez un anticorps primaire de souris pour immunomarquer les tissus de souris, effectuez une étape de blocage supplémentaire. Des réactifs de blocage de la souris sur la souris (bloc de la souris sur la souris ; voir le tableau des matériaux) sont disponibles dans le commerce ; Suivez les instructions commerciales lors de la préparation du bloc souris sur souris. Tapotez doucement la solution de blocage et ajoutez immédiatement le bloc souris sur souris préparé pour couvrir le tissu (~100 μL). Répétez l’opération pour chaque lame contenant du tissu de souris, qui sera coloré à l’aide d’un anticorps primaire élevé chez la souris. Incuber des sections de tissus dans la boîte de la chambre humidifiée à température ambiante pendant 15 min. Retirez les lames de la chambre humidifiée et placez-les directement dans un support à lames immergé dans du PBS. Laissez les diapositives dans PBS pendant 5 minutes pour éliminer le bloc souris sur souris. 10. Anticorps primaires Pour chaque lame, sélectionnez des anticorps primaires d’intérêt qui sont cultivés chez différentes espèces. Diluer les anticorps primaires dans le diluant d’anticorps selon les instructions du fabricant. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-CATÉNINE (1:200) et LAMP1 (1:50).REMARQUE : Si le fabricant ne fournit pas les dilutions recommandées, une dilution de 1:100 est un bon point de départ. Si l’anticorps primaire d’intérêt est conjugué à un fluorophore, voir étape 12.2.Pour fabriquer le diluant de l’anticorps, ajoutez un tampon de blocage 1:20 au PBS, si vous utilisez le tampon de blocage de la gélatine de poisson décrit ci-dessus. Retirez les lames du PBS ou de la chambre humidifiée, tapotez doucement l’excès de solution de blocage ou de PBS et remettez-les horizontalement dans la chambre humidifiée. Assurez-vous que la barrière créée avec le stylo hydrophobe à l’étape 8.3 persiste ; tracez à nouveau le contour du tissu si nécessaire. Ajouter des anticorps primaires d’intérêt suffisamment dilués pour couvrir le tissu (~100 μL). Fermez la chambre humidifiée et incubez les lames sur une surface plane à 4 °C dans l’obscurité pendant la nuit. 11. Lavage des lames Retirez les lames de la chambre humidifiée, tapotez doucement les anticorps primaires et placez les lames dans un support à lames immergé dans du PBS pendant 5 min. Retirez la grille coulissante et placez-la dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli de PBS pendant 5 min. Répétez l’étape 1x. 12. Anticorps secondaires et contre-coloration des noyaux Pour chaque lame, sélectionnez des fluorophores d’anticorps secondaires conçus pour se lier à l’espèce d’anticorps primaire. Diluez des fluorophores d’anticorps secondaires ou des anticorps primaires conjugués dans un diluant d’anticorps secondaire. Les anticorps secondaires utilisés étaient l’anti-chèvre d’âne 488 (1:200), l’anti-lapin d’âne cy3 (1:200), l’anti-souris d’âne 647 (1:200), l’anti-lapin d’âne 647 (1:200) et l’anti-rat d’âne cy3 (1:200). L’anticorps primaire γ-ACTINE conjugué au fluorophore 647 a été utilisé à une dilution de 1:100.Pour fabriquer un diluant d’anticorps secondaire, ajoutez un tampon de blocage 1:100 au PBS, si vous utilisez un tampon de blocage de la gélatine de poisson comme décrit ci-dessus. Retirez les lames du PBS, tapotez doucement pour enlever l’excès de PBS et remettez-les horizontalement dans la chambre humidifiée. Assurez-vous que la barrière créée avec le stylo hydrophobe à l’étape 8.3 persiste ; tracez à nouveau le contour du tissu si nécessaire. Ajouter des fluorophores d’anticorps secondaires suffisamment dilués ou des anticorps primaires conjugués d’intérêt pour couvrir le tissu (~100 μL). Fermez la chambre humidifiée et incubez les lames à température ambiante dans l’obscurité pendant 1 h. Diluer 10 mg/mL de Hoechst (voir le tableau des matériaux) ou de DAPI à l’aide de PBS pour une concentration finale de 1 μg/mL de Hoechst ou de DAPI à l’aide de PBS et ajouter directement au tissu (~100 μL). Incuber 5 min à température ambiante dans l’obscurité. Retirez les lames de la chambre humidifiée et placez-les dans un support à lames immergé dans du PBS pendant 5 minutes dans l’obscurité. Retirez la grille coulissante et placez-la dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli de PBS pendant 5 minutes dans l’obscurité. Répétez l’étape 1x. 13. Montage et préparation pour la microscopie Retirez une diapositive à la fois du support de diapositives immergé dans PBS, en gardant les diapositives restantes immergées dans PBS dans l’obscurité. Tapotez doucement pour enlever l’excès de PBS et, si nécessaire, utilisez une lingette non pelucheuse pour essuyer soigneusement l’excès de PBS sur la lame de verre, en évitant le tissu. Ajoutez une à deux gouttes de produit de montage antifade (voir tableau des matériaux) au centre du tissu. Tenez une lamelle propre (voir tableau des matériaux ) par les bords et abaissez-la lentement sur la glissière à un angle de 45°. Assurez-vous que le produit de montage s’étale uniformément sur le tissu. En commençant par le centre du tissu, appuyez doucement sur la lamelle avec deux doigts pour aider à éliminer les bulles d’air et l’excès de milieu de montage. Si nécessaire, continuez à appuyer vers les bords et maintenez une légère pression tout au long. Coupez la petite extrémité d’une pipette P200 non filtrée et fixez-la à l’extrémité d’une pipette sérologique connectée à un vide. En suivant les bords de la lamelle, utilisez l’aspirateur pour retirer l’excès de support de montage. Dans une nouvelle boîte à diapositives, posez la diapositive horizontalement à plat et laissez-la sécher dans l’obscurité à température ambiante. Répétez ce processus pour chaque diapositive.