Summary

Électroporation à base de substrat poreux avec surveillance de l’impédance électrique transépithéliale

Published: September 27, 2024
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Summary

L’électroporation de substrat poreux (PSEP) associe une distribution constante et à haut débit à une viabilité élevée des cellules. L’introduction de mesures d’impédance électrique transépithéliale (TEEI) donne un aperçu des processus intermédiaires du PSEP et permet une administration sans étiquette. Cet article traite d’une méthode permettant d’effectuer simultanément des expériences d’administration PSEP et une analyse de mesure TEEI.

Abstract

L’électroporation sur substrat poreux (PSEP) est une méthode émergente d’électroporation qui offre un débit élevé et une livraison constante. Comme de nombreux autres types d’administration intracellulaire, le PSEP s’appuie fortement sur des marqueurs fluorescents et la microscopie fluorescente pour déterminer la réussite de l’administration. Pour mieux comprendre les étapes intermédiaires du processus d’électroporation, une plateforme PSEP avec surveillance intégrée de l’impédance électrique transépithéliale (TEEI) a été développée. Les cellules sont cultivées dans des inserts disponibles dans le commerce avec des membranes poreuses. Après une période d’incubation de 12 h pour permettre la formation d’une monocouche cellulaire entièrement confluente, les inserts sont placés dans un milieu de transfection situé dans les puits du dispositif PSEP. Les monocouches cellulaires sont ensuite soumises à une forme d’onde définie par l’utilisateur, et l’efficacité de distribution est confirmée par la microscopie fluorescente. Ce flux de travail peut être considérablement amélioré grâce à des mesures TEEI entre la microscopie pulsée et la microscopie fluorescente pour collecter des données supplémentaires sur le processus PSEP, et ces données TEEI supplémentaires sont corrélées avec des paramètres de livraison tels que l’efficacité et la viabilité de la livraison. Cet article décrit un protocole permettant d’effectuer des mesures PSEP avec TEEI.

Introduction

L’électroporation est une technique dans laquelle les cellules sont exposées à un champ électrique, créant des pores temporaires dans la membrane cellulaire à travers lesquels les marchandises, y compris les protéines, l’ARN et l’ADN, peuvent passer 1,2. La version la plus utilisée est l’électroporation en vrac (BEP). La PEB est réalisée en remplissant une cuvette avec un électrolyte contenant des millions de cellules, en exposant l’électrolyte à une haute tension et en permettant à la cargaison de pénétrer dans les cellules par diffusion ou endocytose1. Les BEP présentent de nombreux avantages, notamment un débit élevé et de nombreux systèmes disponibles dans le commerce. Cependant, il existe des limites à la livraison du BEP. Le positionnement incohérent des cellules par rapport aux électrodes et le blindage du champ électrique par rapport aux cellules adjacentes entraînent une variabilité significative de l’exposition au champ électrique pendant les PEB3 et 4. La haute tension requise pour le BEP a également un impact négatif significatif sur la viabilité des cellules5. Depuis sa création en 20116, il y a eu un intérêt croissant pour une méthode d’électroporation appelée électroporation sur substrat poreux (PSEP), bien qu’elle soit parfois désignée par d’autres noms, notamment l’électroporation localisée et la nano- ou micro-électroporation 1,7,8. Contrairement à la suspension cellulaire de BEP, la PSEP est réalisée sur des cellules qui adhèrent à un substrat poreux. Non seulement un état d’adhérence est préféré pour la majorité des lignées cellulaires humaines9, mais les pores du substrat se concentrent également sur le courant électrique, localisant le potentiel électrique transmembranaire (TMP) dans des régions spécifiques de la membrane cellulaire10,11. Cette localisation permet une réduction significative de la tension appliquée, diminuant les dommages et augmentant la viabilité des cellules. Cette combinaison d’effets aide à contrôler le développement des pores de la membrane cellulaire, ce qui se traduit par une administration plus cohérente et plus efficace 1,5,12.

Une étude récente a présenté un dispositif PSEP doté d’un réseau d’électrodes plaquées or à six puits pour maintenir des inserts de membrane poreuse disponibles dans le commerce13 (figures 1A, B), une pratique qui a été introduite pour la première fois par Vindis et al.14. L’appareil peut appliquer des impulsions et mesurer l’impédance électrique à travers la monocouche de cellule, connue sous le nom d’impédance électrique transépithéliale (TEEI), en temps réel13. L’interface utilisateur de l’appareil permet un contrôle total de la forme d’onde et de la polarité de l’électroporation. Il est important de noter que les mesures d’impédance en temps réel peuvent être utilisées pour prédire les résultats de l’administration sans avoir besoin de réactifs coûteux ou de marqueurs fluorescents, un concept connu sous le nom d’administration sans marquage15.

La plate-forme PSEP se compose de deux principaux composants électriques personnalisés : le corps principal de l’appareil, qui abrite le générateur d’impulsions et l’équipement de mesure TEEI, et le réseau d’électrodes, où les substrats poreux sont insérés et où l’électroporation se produit. Des diagrammes pour tous les composants électroniques personnalisés et imprimés en 3D peuvent être trouvés sur GitHub : https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. En plus de l’électronique personnalisée, un ordinateur est également nécessaire au bon fonctionnement de la plate-forme. Le logiciel personnalisé nécessite MATLAB (version 2021a ou ultérieure) pour s’exécuter, et Microsoft Excel pour stocker et accéder aux données à des fins d’analyse. Le programme contrôle l’électronique personnalisée et fournit l’interface utilisateur graphique (GUI) pour ajuster les paramètres. Ces programmes ont également été mis à disposition sur GitHub : https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

Les données préliminaires suggèrent que ce processus est possible pour différents types de cellules adhérentes (Figure 1C), mais cet article ne traitera que de la préparation des cellules A431 à l’aide de paramètres qui se sont avérés optimaux pour cette lignée cellulaire par Brooks et al.13. De plus, comme la cargaison d’iodure de propidium (PI) est cytotoxique, deux expériences sont réalisées, la première avec un milieu de transfection PI à haute concentration pour quantifier l’efficacité de l’administration, et la seconde avec uniquement des milieux de culture cellulaire pour mesurer l’EIEO sur des échelles de temps plus longues. Ces expériences utilisent des formes d’onde d’électroporation identiques, ce qui permet de corréler les résultats (Figure 1D).

Figure 1
Figure 1 : Schéma d’assemblage du réseau d’électrodes et données de base. (A) Modèle CAO d’un insert à l’intérieur d’un puits du réseau d’électrodes. (B) Modèle CAO du réseau d’électrodes. (C) Augmentation de l’impédance due au PSEP pour certaines lignées cellulaires, n = 3 par lignée cellulaire. Barre d’erreur : erreur type de la moyenne. (D) Efficacité de la livraison vs. TEEI augmenter les données de corrélation. L’efficacité de livraison a été calculée en divisant le nombre de cellules étiquetées dans les images PI et calcein des expériences de livraison par le nombre total de cellules identifiées avec Hoechst. Le nombre de cellules a été déterminé à l’aide d’un pipeline CellProfiler personnalisé, n = 6 par tension. Barre d’erreur : erreur type (axes x et y) de la moyenne. Cette figure est reproduite à partir de Brooks et al.13 avec autorisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux. 1. Préparation des réactifs et culture cellulaire Préparez le milieu de culture cellulaire en ajoutant 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de pénicilline-streptomycine dans un contenant de 500 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM). Produire onze aliquotes de 50 mL pour réduire…

Representative Results

Le protocole donné établit une méthode d’utilisation des mesures TEEI pour examiner les processus intermédiaires d’électroporation et faire des prédictions de livraison, en particulier pour la lignée cellulaire A431 et le fret PI. Bien que la modification de ce protocole soit abordée plus loin dans l’article, il est important de noter maintenant que même si les valeurs spécifiques peuvent changer, les tendances générales de la réponse restent constantes. Par exemple, l…

Discussion

La figure 2C montre que les augmentations par rapport au minimum et les diminutions par rapport à la ligne de base sont tracées pour chaque tension de forme d’onde PSEP. L’augmentation TEEI crée un arc parabolique, culminant autour de 20 volts avant de diminuer, tandis que la diminution TEEI par rapport à la ligne de base augmente de manière exponentielle à mesure que la tension augmente. L’efficacité de la distribution et les pourcentages de mo…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à souligner le soutien financier de la NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), des National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) et de l’P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), de la Nebraska Collaborative Initiative et du Voelte-Keegan Bioengineering Support. Le dispositif a été fabriqué au NanoEngineering Research Core Facility (NERCF), qui est partiellement financé par la Nebraska Research Initiative.

Materials

15 mL Conical Centrifuge Tube Thermo Scientific 339651
2-Chip Disposable Hemocytometer Bulldog Bio DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask fisherbrand FB012937
A431 Cells ATCC CRL-1555
Calcein AM Invitrogen C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet Labgard NU-543-600
Custom Components YangLab https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) fisherbrand 05-539-6
DMEM Gibco 11965092
Fetal Bovine Serum Gibco A5670401
Fluid Aspiration System vacuubrand 20727403
HERACELL 240i Thermo Scientific 51026331
Hoechst 33342 Thermo Scientific 62249
Human Plasma Fibronectin Sigma-Aldrich FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope Zeiss 491916-0001-000
Inverted Microscope Labomed TCM 400
PBS cytiva SH30256.02
PCR Tube 200 µL Sarstedt 72.737
Penicillin / Streptomycin Gibco 15140148
Pipette (0.2-2 µL) fisherbrand Elite FBE00002
Pipette (100-1000 µL) fisherbrand Elite FBE01000
Pipette (20-200 µL) fisherbrand Elite FBE00200
Pipette (2-20 µL) fisherbrand Elite FBE00020
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL Sarstedt 72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004240
Thincert (24-well) Greiner Bio-One 662 641 0.4 µm pore diameter, 2×106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well) fisherbrand FB012929
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154-20mL
Trypsin Gibco 15090046

References

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Citer Cet Article
Lorenzen, S. R., Brooks, J. R., Heiman, T. C., Yang, R. Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring. J. Vis. Exp. (211), e66971, doi:10.3791/66971 (2024).

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