L’identification de biomarqueurs d’ARN et de protéines à partir de déchirures dans des modèles murins est très prometteuse pour le diagnostic précoce de diverses maladies. Ce manuscrit fournit un protocole complet pour optimiser l’efficacité et l’efficience de l’isolement de l’ARNm et des protéines à partir de larmes de souris.
Le film lacrymal est un biofluide hautement dynamique capable de refléter les changements moléculaires associés à la pathologie, non seulement dans la surface oculaire, mais aussi dans d’autres tissus et organes. L’analyse moléculaire de ce biofluide offre un moyen non invasif de diagnostiquer ou de surveiller des maladies, d’évaluer l’efficacité d’un traitement médical et d’identifier d’éventuels biomarqueurs. En raison du volume d’échantillon limité, la collecte d’échantillons lacrymaux nécessite des compétences spécifiques et des outils appropriés pour garantir une qualité élevée et une efficacité maximale. Diverses méthodologies d’échantillonnage des larmes ont été décrites dans des études humaines. Dans cet article, une description complète d’un protocole optimisé est présentée, spécialement conçu pour extraire des informations sur les protéines liées aux larmes à partir de modèles animaux expérimentaux, en particulier de souris. Cette méthode comprend la stimulation pharmacologique de la production de larmes chez des souris âgées de 2 mois, suivie d’un prélèvement d’échantillons à l’aide de bandelettes Schirmer et de l’évaluation de l’efficacité et de l’efficience du protocole par des procédures standard, SDS-PAGE, qPCR et PCR numérique (dPCR). Ce protocole peut être facilement adapté pour l’étude de la signature de la protéine lacrymale dans une variété de paradigmes expérimentaux. En établissant un protocole d’échantillonnage des larmes abordable, standardisé et optimisé pour les modèles animaux, l’objectif était de combler le fossé entre la recherche humaine et animale, en facilitant les études translationnelles et en accélérant les progrès dans le domaine de la recherche sur les maladies oculaires et systémiques.
Les larmes sont considérées comme un ultrafiltrat plasmatique et ont également été décrites comme un liquide intermédiaire entre le sérum plasmatique et le liquide céphalo-rachidien en raison d’un chevauchement important des biomolécules qu’elles partagent1. Il a été rapporté que les larmes humaines contiennent des protéines, des lipides lacrymaux, des métabolites et des électrolytes2. Récemment, d’autres biomolécules telles que les ARNm, les miARN et les vésicules extracellulaires ont également été identifiées 3,4,5,6,7.
Chez l’homme, les déchirures basales sont situées dans le film lacrymal, qui se compose de trois couches : la couche lipidique externe, qui maintient la surface des larmes lisse pour nous permettre de voir à travers et d’empêcher l’évaporation des larmes ; la couche aqueuse moyenne, qui maintient l’œil hydraté, repousse les bactéries, protège la cornée et constitue 90 % du film lacrymal ; et enfin, la couche de mucine, une famille de protéines de haut poids moléculaire qui sont en contact avec la cornée et permettent à la larme d’adhérer à l’œil8. La distribution des larmes sur la surface oculaire commence par la sécrétion de la glande lacrymale. Ce liquide est ensuite guidé à travers les canaux lacrymaux pour passer sur la surface de l’œil et s’écouler dans des canaux de drainage. Chaque clignement permet aux larmes de se disperser uniformément sur l’ensemble de l’œil, le gardant humide9.
Le film lacrymal est un biofluide hautement dynamique capable de refléter les changements moléculaires qui se produisent non seulement sur la surface oculaire, mais aussi dans d’autres tissus et organes. L’analyse de l’expression différentielle dans ce biofluide représente une approche prometteuse pour la découverte de biomarqueurs dans les maladies humaines10,11. L’utilisation du film lacrymal comme source de biomarqueurs pour le diagnostic précoce de diverses pathologies a été grandement facilitée par la présence de méthodes de collecte non invasives. La méthode la plus courante pour recueillir les larmes dans les cliniques humaines et vétérinaires implique un support à base de membrane (bande de Schirmer), qui fonctionne sur le principe de l’action capillaire, permettant à l’eau contenue dans les larmes de se déplacer sur la longueur d’une bandelette de test en papier ou de tubes capillaires placés dans le sac conjonctival inférieur du sujet 12,13,14. Malgré la limitation inhérente à l’obtention d’un petit volume d’échantillon par cette méthode, l’analyse biochimique de la composition des larmes à l’aide de diverses techniques sensibles a facilité l’identification de molécules biomarqueurs potentielles11,15. Les protocoles d’optimisation et d’évaluation de l’élution des protéines lacrymales à partir des bandelettes et des capillaires de Schirmer chez les patients humains sont bien documentés16,17. Cependant, il existe des descriptions complètes de protocoles optimisés spécialement conçus pour extraire des informations moléculaires liées aux déchirures à partir de modèles animaux expérimentaux, mais elles sont rares. Les méthodes existantes, telles que l’induction de larmes par stimulation directe de la glande lacrymale18, tout en permettant la collecte de plus grands volumes, sont invasives et peuvent causer de l’inconfort aux animaux. Des méthodes non invasives, telles que la collecte de larmes sur la surface oculaire, ont été décrites comme un moyen d’isoler l’ADN et les miARN19,21.
Ce protocole vise à établir une méthode rentable et optimisée pour la collecte et le traitement des larmes chez la souris. La méthode privilégie la non-invasivité tout en obtenant des volumes de larmes suffisants adaptés à l’analyse moléculaire grâce à des techniques telles que SDS-PAGE, qPCR et dPCR. Les informations extraites sur le contenu des protéines et de l’ARNm peuvent ensuite être utilisées pour identifier des biomarqueurs potentiels dans les modèles expérimentaux existants de la maladie.
Le liquide lacrymal est facilement accessible, et la détermination de biomarqueurs dans les larmes peut être utilisée comme une technique complémentaire réussie pour le diagnostic précoce de diverses maladies humaines27. Bien que l’analyse biochimique de la composition des larmes dans des modèles animaux expérimentaux complète cette approche et promette des progrès significatifs dans la compréhension de la base moléculaire des maladies, les données et les protocoles disponibles sont…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par VELUX STIFTUNG [projet 1852] à M.L. et des bourses de troisième cycle de CONAHCYT à M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) et A.M.F (CVU 1317418). Sincère gratitude à tous les membres du laboratoire, du Centro de Investigación sobre el Envejecimiento et du Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) pour leurs contributions à ces discussions stimulantes.
2-mercaptoethanol | Gibco | 1985023 | |
2x Laemmli buffer | Bio-Rad | 16-0737 | |
Acetic Acid | Quimica Meyer | 64-19-7 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 1003045143 | |
Coomassie Blue R 250 | US Biological | 6104-59-2 | |
Ethanol | Quimica Rique | 64-17-5 | |
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder | Thermofisher scientific | SM1331 | |
Glycerol | US Biological | G8145 | |
Glycine | SANTA CRUZ | SC- 29096 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
HCl | Quimica Rique | 7647-01-0 | |
Isopropyl alcohol | Quimica Rique | 67-63-0 | |
Methanol | Quimica Meyer | 67-56-1 | |
Micro tubes 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micro tubes 600 µl | Axygen | MCT-060-C | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
PCR tubes & strips | Novasbio | PCR 0104 | |
Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-10g | |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 | |
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL) | Qiagen | 250112 | |
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10) | Qiagen | 250001 | |
Real qPlus 2x Master Mix Green | Ampliqon | A323402 | |
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit | Thermofisher scientific | K1622 | |
Schirmer's test strips | Laboratorio Santgar | SANT1553 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
TEMED | Sigma aldrich | 102560430 | |
TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424-200ML | monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate |
Tris | US Biological | T8650 | |
Tris base | Chem Cruz | sc-3715A |