Summary

Optimisation de la collecte de larmes chez la souris pour l’analyse de l’ARNm et des protéines

Published: July 19, 2024
doi:

Summary

L’identification de biomarqueurs d’ARN et de protéines à partir de déchirures dans des modèles murins est très prometteuse pour le diagnostic précoce de diverses maladies. Ce manuscrit fournit un protocole complet pour optimiser l’efficacité et l’efficience de l’isolement de l’ARNm et des protéines à partir de larmes de souris.

Abstract

Le film lacrymal est un biofluide hautement dynamique capable de refléter les changements moléculaires associés à la pathologie, non seulement dans la surface oculaire, mais aussi dans d’autres tissus et organes. L’analyse moléculaire de ce biofluide offre un moyen non invasif de diagnostiquer ou de surveiller des maladies, d’évaluer l’efficacité d’un traitement médical et d’identifier d’éventuels biomarqueurs. En raison du volume d’échantillon limité, la collecte d’échantillons lacrymaux nécessite des compétences spécifiques et des outils appropriés pour garantir une qualité élevée et une efficacité maximale. Diverses méthodologies d’échantillonnage des larmes ont été décrites dans des études humaines. Dans cet article, une description complète d’un protocole optimisé est présentée, spécialement conçu pour extraire des informations sur les protéines liées aux larmes à partir de modèles animaux expérimentaux, en particulier de souris. Cette méthode comprend la stimulation pharmacologique de la production de larmes chez des souris âgées de 2 mois, suivie d’un prélèvement d’échantillons à l’aide de bandelettes Schirmer et de l’évaluation de l’efficacité et de l’efficience du protocole par des procédures standard, SDS-PAGE, qPCR et PCR numérique (dPCR). Ce protocole peut être facilement adapté pour l’étude de la signature de la protéine lacrymale dans une variété de paradigmes expérimentaux. En établissant un protocole d’échantillonnage des larmes abordable, standardisé et optimisé pour les modèles animaux, l’objectif était de combler le fossé entre la recherche humaine et animale, en facilitant les études translationnelles et en accélérant les progrès dans le domaine de la recherche sur les maladies oculaires et systémiques.

Introduction

Les larmes sont considérées comme un ultrafiltrat plasmatique et ont également été décrites comme un liquide intermédiaire entre le sérum plasmatique et le liquide céphalo-rachidien en raison d’un chevauchement important des biomolécules qu’elles partagent1. Il a été rapporté que les larmes humaines contiennent des protéines, des lipides lacrymaux, des métabolites et des électrolytes2. Récemment, d’autres biomolécules telles que les ARNm, les miARN et les vésicules extracellulaires ont également été identifiées 3,4,5,6,7.

Chez l’homme, les déchirures basales sont situées dans le film lacrymal, qui se compose de trois couches : la couche lipidique externe, qui maintient la surface des larmes lisse pour nous permettre de voir à travers et d’empêcher l’évaporation des larmes ; la couche aqueuse moyenne, qui maintient l’œil hydraté, repousse les bactéries, protège la cornée et constitue 90 % du film lacrymal ; et enfin, la couche de mucine, une famille de protéines de haut poids moléculaire qui sont en contact avec la cornée et permettent à la larme d’adhérer à l’œil8. La distribution des larmes sur la surface oculaire commence par la sécrétion de la glande lacrymale. Ce liquide est ensuite guidé à travers les canaux lacrymaux pour passer sur la surface de l’œil et s’écouler dans des canaux de drainage. Chaque clignement permet aux larmes de se disperser uniformément sur l’ensemble de l’œil, le gardant humide9.

Le film lacrymal est un biofluide hautement dynamique capable de refléter les changements moléculaires qui se produisent non seulement sur la surface oculaire, mais aussi dans d’autres tissus et organes. L’analyse de l’expression différentielle dans ce biofluide représente une approche prometteuse pour la découverte de biomarqueurs dans les maladies humaines10,11. L’utilisation du film lacrymal comme source de biomarqueurs pour le diagnostic précoce de diverses pathologies a été grandement facilitée par la présence de méthodes de collecte non invasives. La méthode la plus courante pour recueillir les larmes dans les cliniques humaines et vétérinaires implique un support à base de membrane (bande de Schirmer), qui fonctionne sur le principe de l’action capillaire, permettant à l’eau contenue dans les larmes de se déplacer sur la longueur d’une bandelette de test en papier ou de tubes capillaires placés dans le sac conjonctival inférieur du sujet 12,13,14. Malgré la limitation inhérente à l’obtention d’un petit volume d’échantillon par cette méthode, l’analyse biochimique de la composition des larmes à l’aide de diverses techniques sensibles a facilité l’identification de molécules biomarqueurs potentielles11,15. Les protocoles d’optimisation et d’évaluation de l’élution des protéines lacrymales à partir des bandelettes et des capillaires de Schirmer chez les patients humains sont bien documentés16,17. Cependant, il existe des descriptions complètes de protocoles optimisés spécialement conçus pour extraire des informations moléculaires liées aux déchirures à partir de modèles animaux expérimentaux, mais elles sont rares. Les méthodes existantes, telles que l’induction de larmes par stimulation directe de la glande lacrymale18, tout en permettant la collecte de plus grands volumes, sont invasives et peuvent causer de l’inconfort aux animaux. Des méthodes non invasives, telles que la collecte de larmes sur la surface oculaire, ont été décrites comme un moyen d’isoler l’ADN et les miARN19,21.

Ce protocole vise à établir une méthode rentable et optimisée pour la collecte et le traitement des larmes chez la souris. La méthode privilégie la non-invasivité tout en obtenant des volumes de larmes suffisants adaptés à l’analyse moléculaire grâce à des techniques telles que SDS-PAGE, qPCR et dPCR. Les informations extraites sur le contenu des protéines et de l’ARNm peuvent ensuite être utilisées pour identifier des biomarqueurs potentiels dans les modèles expérimentaux existants de la maladie.

Protocol

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par le Comité d’Éthique Animale de Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Les animaux de laboratoire ont été traités et manipulés en stricte conformité avec les directives d’utilisation des animaux de la revue et conformément à la déclaration de l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. La santé oculaire avant et après les procédures a été évaluée…

Representative Results

Le protocole décrit dans cet article fournit une méthode simple et abordable pour obtenir des informations moléculaires à partir de liquide lacrymal en utilisant des techniques couramment disponibles dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. De plus, le protocole peut être mis à l’échelle en utilisant des techniques très sensibles telles que ELISA pour la détection de l’activité enzymatique. Après ces procédures, le rendement total en protéines était d’envi…

Discussion

Le liquide lacrymal est facilement accessible, et la détermination de biomarqueurs dans les larmes peut être utilisée comme une technique complémentaire réussie pour le diagnostic précoce de diverses maladies humaines27. Bien que l’analyse biochimique de la composition des larmes dans des modèles animaux expérimentaux complète cette approche et promette des progrès significatifs dans la compréhension de la base moléculaire des maladies, les données et les protocoles disponibles sont…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par VELUX STIFTUNG [projet 1852] à M.L. et des bourses de troisième cycle de CONAHCYT à M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) et A.M.F (CVU 1317418). Sincère gratitude à tous les membres du laboratoire, du Centro de Investigación sobre el Envejecimiento et du Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) pour leurs contributions à ces discussions stimulantes.

Materials

2-mercaptoethanol Gibco 1985023
2x Laemmli buffer Bio-Rad 16-0737
Acetic Acid Quimica Meyer 64-19-7
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
Bradford Reagent Sigma-Aldrich B6916
Chloroform Sigma-Aldrich 1003045143
Coomassie Blue R 250 US Biological 6104-59-2
Ethanol Quimica Rique 64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder Thermofisher scientific SM1331
Glycerol US Biological G8145
Glycine SANTA CRUZ SC- 29096
Glycogen Roche 10901393001
HCl Quimica Rique 7647-01-0
Isopropyl alcohol Quimica Rique 67-63-0
Methanol Quimica Meyer 67-56-1
Micro tubes 1.5 ml Axygen MCT-150-C
Micro tubes 600 µl Axygen MCT-060-C
NaCl Sigma-Aldrich S3014
PCR tubes & strips Novasbio PCR 0104
Pilocarpine Sigma-Aldrich P6503-10g
Protease inhibitor Roche 11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL) Qiagen 250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10) Qiagen 250001
Real qPlus 2x Master Mix Green Ampliqon A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit Thermofisher scientific K1622
Schirmer's test strips Laboratorio Santgar SANT1553
SDS Sigma-Aldrich L3771
TEMED Sigma aldrich 102560430
TRI reagent Sigma-Aldrich T9424-200ML monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris US Biological T8650
Tris base Chem Cruz sc-3715A

References

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884 (2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101 (2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483 (2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679 (2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301 (2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390 (2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363 (2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064 (2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer’s strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren’s syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254 (2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377 (2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023)
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15 (2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886 (2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

Play Video

Citer Cet Article
Bello, M., Morales-Farfán, A., Martínez-Colín, E. J., Lezama, I., Lamas, M. Optimizing Tear Collection in Mice for mRNA and Protein Analysis. J. Vis. Exp. (209), e66955, doi:10.3791/66955 (2024).

View Video