Ce protocole décrit un système d’air de surpression personnalisé conçu pour induire des lésions du système nerveux central (SNC) en système fermé chez la souris, y compris des traumatismes oculaires, cérébraux et de la moelle épinière. L’objectif de ce protocole est de fournir un cadre permettant aux chercheurs d’adapter et d’étendre facilement le système pour leurs études uniques sur les traumatismes du SNC.
La prévalence des lésions du système fermé du système nerveux central (SNC) souligne la nécessité d’une meilleure compréhension de ces traumatismes afin d’améliorer les interventions protectrices et thérapeutiques. Des modèles animaux qui reproduisent les lésions du SNC en système fermé sont essentiels à cette recherche. Dans ce contexte, un système d’air de surpression personnalisé a été conçu pour reproduire une gamme de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins, y compris des traumatismes oculaires, cérébraux et de la moelle épinière. À ce jour, le système a été utilisé pour administrer de l’air de surpression dirigé vers les yeux, la tête ou la colonne vertébrale afin de modéliser les lésions du pôle antéropostérieur de l’œil, la neuropathie optique traumatique indirecte (ITON), les lésions cérébrales traumatiques focales et les lésions de la moelle épinière. Cet article fournit un protocole détaillé décrivant la conception et le fonctionnement du système et présente des résultats représentatifs démontrant son efficacité. Le cadre solide présenté ici fournit une base solide pour la recherche en cours sur les traumatismes du SNC. En tirant parti des attributs flexibles du système, les enquêteurs peuvent modifier et contrôler soigneusement l’emplacement, la gravité et le moment des blessures. Cela permet des comparaisons complètes des mécanismes moléculaires et de l’efficacité thérapeutique de plusieurs lésions du SNC en système fermé.
Les lésions du système fermé du système nerveux central (SNC) sont des blessures causées par des lésions au cerveau ou à la moelle épinière sans causer de rupture du crâne ou de la colonne vertébrale. Ces blessures comprennent les traumatismes crâniens (TCC) et les lésions de la moelle épinière (LME) et peuvent survenir à la suite de divers incidents, y compris des blessures contondantes (p. ex., chutes, blessures sportives, accidents de la route) et des explosions explosives. Les lésions du SNC en système fermé sont généralement considérées comme moins graves que les lésions pénétrantes du SNC, mais elles se produisent plus souvent. Cependant, à l’instar des blessures pénétrantes, les lésions du SNC en système fermé peuvent entraîner des problèmes de santé à long terme et progressifs, en particulier après des événements répétés 1,2,3,4,5,6. Il est inquiétant de constater que même les lésions subcliniques du SNC en système fermé, qui ne répondent pas aux critères diagnostiques d’un traumatisme crânien ou d’une lésion médullaire après un seul événement 7,8,9,10,11,12,13, peuvent évoluer vers des maladies neurodégénératives chroniques après des lésions répétées 6,14,15,16. Cela souligne la nécessité urgente de mieux comprendre les mécanismes et les conséquences des lésions uniques et répétées du SNC en système fermé. Ces connaissances sont impératives pour améliorer les approches protectrices et thérapeutiques. Des modèles animaux qui reproduisent les lésions du SNC en système fermé sont essentiels à cette entreprise.
Les modèles animaux actuels de lésions du SNC en système fermé ont joué un rôle déterminant dans l’avancement de notre compréhension de la physiopathologie et des interventions protectrices et thérapeutiques potentielles pour ces traumatismes. Les rongeurs sont particulièrement populaires en raison de leur faible coût, de leur disponibilité, de leur manipulabilité génétique, de leur facilité de manipulation, de leurs tests comportementaux et physiologiques bien établis et de considérations éthiques plus favorables17. Les méthodes courantes pour induire un TCC en système fermé chez les rongeurs comprennent les dispositifs de chute de poids18,19, les dispositifs d’impact cortical contrôlé (CCI)20 et les tubes de choc à air comprimé21. Pour les lésions médullaires, les modèles de traumatisme contondant nécessitent généralement une laminectomie22,23 ou d’autres techniques chirurgicales24 pour accéder directement à la moelle épinière ou à l’espace péridural. Cependant, des modèles de lésions par souffle à fuselage minime à corps fermé ont été mis au point à l’aide de tubes de choc à air comprimé 25. Bien qu’ils fournissent des informations précieuses, chacun de ces modèles présente des limites uniques. Les modèles de perte de poids peuvent présenter une grande variabilité et un contrôle limité de l’emplacement et de la gravité des blessures, ce qui soulève des préoccupations expérimentales et éthiques quant à la cause de blessures graves et incontrôlées26. Les dispositifs CCI offrent une précision mais nécessitent une formation pour fonctionner, peuvent impliquer une craniotomie et peuvent souffrir d’une variabilité mécanique affectant la reproductibilité27. Les tubes à chocs sont généralement moins invasifs, mais peuvent être difficiles à acquérir, complexes à installer et à utiliser, et peuvent créer des conditions de blessure irréalistes et très variables en raison de facteurs environnementaux, de réflexions d’ondes et d’interactions de pression complexes28.
Pour mieux étudier les mécanismes et les effets des lésions uniques et répétées du SNC en système fermé et de leurs traitements, cet article présente une méthode modulaire, conviviale, rentable et non invasive. L’objectif principal de cette approche est de permettre un contrôle précis et une modification souple des paramètres des blessures, y compris l’emplacement, la gravité et le moment. À l’appui de cet objectif, ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour la construction, l’étalonnage et le dépannage d’un système d’air de surpression, qui aborde certaines des limites des dispositifs existants de lésions du SNC en système fermé. Ce système offre non seulement une rentabilité et un temps de configuration minimal, mais il est également très polyvalent, fournissant des résultats cohérents et reproductibles tout en minimisant les problèmes éthiques et en maximisant la pertinence clinique. De plus, la capacité du système à produire une gamme de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins est décrite, ainsi que ses applications potentielles dans des études futures. Notamment, l’objectif de ce manuscrit est de fournir un cadre qui permet aux chercheurs d’acquérir, d’adapter et d’étendre facilement ce système pour leurs besoins spécifiques, faisant ainsi avancer la recherche en cours sur les traumatismes du SNC. Des résultats représentatifs démontrant l’efficacité du système à induire des traumatismes axonaux sont également présentés.
Ce système d’air de surpression personnalisé est un outil utile pour étudier les lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins. Les résultats représentatifs de l’expérience d’exemple démontrent que l’administration focale d’air de surpression à l’aide de ce système peut induire efficacement ITON, entraînant une perte et une dégénérescence axonales importantes. Cela met en évidence la capacité du système à produire des lésions précises et reproductibles du SNC.
L’une des principales forces de ce système est sa personnalisation pour induire une gamme de lésions du SNC. La gravité de la blessure peut être ajustée en modifiant la pression de sortie globale du système, la distance entre l’animal et l’extrémité du canon à l’aide de la platine de positionnement x-y, la taille et la forme de l’ouverture d’exposition, le nombre d’expositions à l’air en surpression et l’intervalle entre les expositions. De plus, l’emplacement de la lésion du SNC peut être ajusté en modifiant l’emplacement de l’ouverture d’exposition à l’intérieur du support d’animal. Cette polyvalence a permis au système de produire un éventail de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins. Initialement, le système a été utilisé pour modéliser les lésions à globe fermé, en se concentrant sur les lésions aux pôles antérieur et postérieur et les déficits associés34,36, y compris les impacts de la réponse du système immunitaire37, les résultats spécifiques à la souche38 et l’efficacité des agents neuroprotecteurs39. Finalement, cette application s’est étendue pour évaluer les séquelles des expositions oculaires répétées afin de modéliser la neuropathie optique traumatique indirecte (ITON)30 et d’explorer l’effet du nombre et de l’intervalle entre les expositions répétées33. Depuis lors, l’application du système s’est étendue au modèle des lésions cérébrales traumatiques légères (TCL) fermées par le biais d’expositions dirigées vers la tête40,41 et des lésions de la moelle épinière à corps fermé (LME) par des expositions dirigées vers le dos42, mettant l’accent sur l’adaptabilité et la polyvalence de l’appareil dans l’étude de divers domaines de lésions du SNC.
Lors de l’utilisation de ce système, il est essentiel de prendre des mesures pour minimiser la variabilité des résultats des blessures afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité des résultats expérimentaux. Les mesures clés comprennent l’étalonnage des niveaux de pression de sortie du système avant et après chaque série de trois expositions afin d’assurer une distribution constante de la pression. Bien que la variabilité soit faible lorsque le système fonctionne entre 15 psi et 50 psi lorsqu’il utilise de l’air comprimé34, un étalonnage cohérent permet de détecter les erreurs inattendues, telles que la batterie faible ou l’air faible. De plus, positionnez chaque animal à la même distance de l’extrémité du canon pour assurer une amplitude de surpression constante, car l’intensité de l’onde de pression diminue avec la distance. Un positionnement uniforme garantit également que chaque animal est touché par la même partie de l’onde. De plus, le fait de fixer uniformément les animaux à l’intérieur du support garantit que les tissus d’intérêt sont ciblés de manière cohérente, en particulier dans les modèles à exposition répétée lorsqu’il y a un risque de mouvement. Enfin, l’uniformité de l’âge, du sexe et du patrimoine génétique des animaux est cruciale, car ces facteurs influencent la réponse aux blessures. Par exemple, des études antérieures utilisant ce système ont comparé les effets de l’air de surpression oculaire sur différentes souches de souris, mettant en évidence des différences significatives dans la réponse aux lésions entre les souris C57Bl/6J36, DBA/2J37 et Balb/c38 . Les souris DBA/2J et Balb/c ont présenté des pathologies du pôle antérieur plus graves, des lésions rétiniennes plus importantes, un stress oxydatif plus élevé et des réponses neuro-inflammatoires plus prononcées par rapport aux souris C57Bl/6J, les souris Balb/c présentant des profils de lésions particulièrement robustes et durables38.
Dépannage du système
Si les valeurs de pression sont inhabituellement basses pour un réglage donné du manomètre, appuyez sur la gâchette 5 à 10 fois, permettant à l’air de passer à travers le système et au régulateur de s’ajuster à un nouveau réglage. Il ne doit pas y avoir de fuites dans le réservoir d’air. Le joint torique du réservoir d’air ne doit pas être endommagé ou usé, le réservoir d’air doit avoir suffisamment d’air et la batterie du pistolet ne doit pas être épuisée. La table x-y ne doit pas s’être déplacée de sa position habituelle à partir de l’extrémité du canon et l’ouverture d’exposition à l’air de surpression doit être alignée avec le canon du pistolet et ne pas l’obstruer. Le régulateur doit être solidement fixé à la poignée du pistolet. Si les valeurs de pression sont trop basses malgré l’utilisation du réglage le plus élevé sur le manomètre, le manomètre ne doit pas être augmenté au-delà de 200 psi et le réglage de vitesse sur le pistolet doit être ajusté au réglage maximum. Si les réglages de pression sont incohérents (par exemple, élevée puis basse), assurez-vous que le réservoir d’air a suffisamment d’air, que le détendeur est bien fixé à la poignée du pistolet, qu’il n’y a pas de fuites dans le réservoir d’air et qu’il est bien vissé, et que le joint torique du réservoir d’air n’est pas endommagé ou usé.
Pour comprendre de manière exhaustive toutes les capacités de ce système, il est important de reconnaître ses limites. Imiter des scénarios du monde réel dans un laboratoire reste un défi. Bien que ce système génère de l’air de surpression, il ne reproduit pas la dynamique complexe d’un événement explosif, comme les variations de gradients de pression et de température, la présence de débris et d’ondes réfléchies, et une nature multiphasique. De plus, il n’imite pas une forme d’onde de Friedlander (« onde de choc primaire »), qui se caractérise par un pic de pression brutal et quasi instantané suivi d’une décroissance exponentielle rapide qui descend en dessous de la pression ambiante avant de revenir à la ligne de base43. Au contraire, la forme d’onde produite par ce système représente un profil plus simple et plus symétrique dans lequel il y a une montée et une descente plus progressives de la pression sans phase négative distincte (voir la figure 2C dans Hines-Beard et al.34). De manière quelque peu avantageuse, cette forme d’onde combine des éléments de blessures dues à l’explosion et aux blessures contondantes. L’« impulsion de pression » en forme de cloche produit un impact de surpression constant, semblable à un « mur d’air » frappant le sujet. Pourtant, la surpression d’air fournie par l’onde est également un aspect clé des blessures causées par les explosions. Certains diront que si cette forme d’onde comprend des aspects des deux types de blessures, elle ne rend pas pleinement compte de la complexité de l’un ou l’autre. Cependant, cette « impulsion de pression » cohérente et reproductible est idéale pour les expériences contrôlées en laboratoire afin d’étudier les lésions focales du SNC en système fermé. Nous avons déjà démontré la nature focale de la blessure. Par exemple, l’exposition à un œil ne cause pas de dommages à l’épithélium nasal primaire ou au cerveau44. De plus, lorsqu’il est dirigé sur le côté de la tête de la souris, une petite zone du cerveau est affectée45. Enfin, l’énergie de l’air de surpression de ce système au niveau de pression utilisé pour ITON n’a pas affecté la souris à moins d’être répétée avec un court intervalle de temps33. Ainsi, la pression n’est pas nuisible et ne reproduit donc pas une force d’extrémité de jet. De plus, même avec une exposition répétée de l’air sous surpression à l’œil, il n’y avait aucun effet sur les structures antérieures de l’œil33. Une dégénérescence significative du nerf optique et une perte de vision ne se sont produites qu’en cas d’exposition répétée avec un intervalle d’exposition inférieur à 1 min33.
Comparé à d’autres appareils de laboratoire pour la création de lésions du SNC en système fermé, ce système offre des avantages uniques. Il peut fournir des rafales séquentielles d’air de surpression en succession rapide (intervalles de 0,5 s)33, imitant les conditions dans les environnements professionnels à haut risque où les expositions rapides aux explosions sont un danger courant. Par exemple, le personnel militaire, tant dans les scénarios d’entraînement que de combat, utilise une foule d’armes à feu automatiques capables de tirer rapidement et à plusieurs reprises, y compris des fusils automatiques (par exemple, M16, AK-47), des mitrailleuses (par exemple, M2 de calibre .50), des mitrailleuses Gatling et des miniguns. D’autres armes plus lentes, mais répétitives, utilisées par le personnel militaire comprennent l’artillerie, les mortiers, les grenades et les engins explosifs improvisés (EEI). Les démolisseurs impliqués dans la démolition contrôlée et les mineurs impliqués dans les opérations de dynamitage pour briser la roche et extraire des minéraux subissent également des explosions séquentielles en succession rapide. Enfin, les travailleurs de la construction utilisant des outils pneumatiques, des batteurs de pieux ou d’autres équipements lourds générant de puissantes forces de percussion peuvent subir des impacts rapides et répétés qui imitent les expositions aux explosions. Notamment, l’administration rapide d’air de surpression n’est pas possible avec des dispositifs tels que les tubes de choc qui nécessitent une reconfiguration ou une repressurisation importante entre chaque événement. Les tubes de choc utilisent des diaphragmes qui éclatent pour générer des ondes de choc, et après chaque rafale, le diaphragme doit être remplacé. Ce processus prend du temps, car le tube de choc doit être ouvert, le diaphragme usé retiré, un nouveau diaphragme installé et le système doit laisser le temps de se réinitialiser et de repressuriser. Ainsi, en particulier pour les études portant sur les lésions du SNC après une exposition rapide et répétée à l’explosion, un système qui ne nécessite pas de reconfiguration ou de repressurisation importante entre chaque événement est idéal.
Les applications futures de ce système modulatoire, convivial et rentable sont prometteuses. Tirant parti de ses attributs adaptables et uniques, ce système ouvre plusieurs pistes prometteuses pour de futures études thérapeutiques précliniques. Sa capacité à fournir des rafales rapides et séquentielles d’air en surpression peut être exploitée pour étudier les effets cumulatifs d’expositions répétées à des explosions, ce qui est pertinent pour comprendre l’encéphalopathie traumatique chronique et d’autres maladies neurodégénératives à long terme. De plus, ce système peut être utilisé pour explorer l’efficacité de diverses interventions pharmacologiques visant à atténuer les lésions du SNC en système fermé, y compris le moment et le dosage des médicaments neuroprotecteurs pour déterminer les fenêtres de traitement optimales. De plus, la précision du système dans l’imitation des aspects des mécanismes de blessures contondantes et explosives permet de développer des modèles de blessures complets qui reflètent les traumatismes complexes vécus par les individus dans des scénarios réels. Cela peut faciliter la mise à l’essai de thérapies multimodales qui s’attaquent aux aspects mondiaux courants des blessures, tels que l’inflammation, le stress oxydatif et la mort neuronale. Dans l’ensemble, ce dispositif offre une plate-forme polyvalente et puissante pour faire progresser notre compréhension des lésions du SNC en système fermé et développer des interventions thérapeutiques efficaces.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le financement du NIH NEI P30 EY008126, de la subvention de découverte Potocsnak en médecine régénérative, du fonds du major-général à la retraite Stephen L. Jones, MD et des fonds non affectés (VEI) de Research Prevent Blindness, Inc.
1-Pentanol | Fisher Scientific | AC160600250 | Used to make Avertin solution |
2,2,2-tribomoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Used to make Avertin solution |
24-well plates with lid | VWR | 76520-634 | 24-well plate |
2-Propanol | Fisher Scientific | A451-1 | |
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module | National Instruments | NI-9237 | DAQ module |
Albumin Bovine Fraction V (BSA) | Research Products International | A30075 | BSA |
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal) | Abcam | ab5076 | Marker for microglia, Used at 1:500 concentration |
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal) | Abcam | ab8049 | Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration |
Araldite GY 502 | Electron Microscopy Sciences | 10900 | |
Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
Charcoal Filter Canister | E-Z Systems | EZ-258 | Collection of anesthetic waste |
Clear H20 DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | Used post blast to aid animal recovery |
CompactDAQ Chassis | National Instruments | USB-9162 | DAQ chassis |
Compressed Air | A-L Gas | GSMCA300 | Used to refill pressurized air tank |
DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | Mounting media with DAPI | |
Diamond knife | Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc. | For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H | |
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594 | Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific) | A-11058 | Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration |
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594 | Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific) | A-21203 | Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration |
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488 | Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific) | A-21206 | Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9662 | NDS |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Fine forceps for whole eye enucleation |
Ethanol (200 proof) | KOPTEC (Supplier: VWR) | 89125-188 | Ethanol |
Fluoromount-G | Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific) | 00-4958-02 | Mounting media |
Genteal Tears Ophthalmic Gel | Covetrus | 72359 | Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
Graduated Cylinder 1000 mL | Fisher Scientific | 08-572G | |
Graduated Cylinder 250 mL | Fisher Scientific | 08-572E | |
Graduated Cylinder 500 mL | Fisher Scientific | 08-572F | |
Heating pad | Braintree Scientific | AP-R 26E | Controlled heating support |
High Pressure Fill Station | Ninja Paintball | HPFSV2 | Used to refill pressurized air tank |
ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software | |
Invert Mini | Empire Paintball | Paintball gun | |
Isoflurane | Covetrus | 29405 | Inhalation anesthetic |
Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | Animal anesthesia |
Masterflex Pump | Cole-Parmer | Used for animal perfusion | |
Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | White glass microscope slides |
NI LabVIEW | National Instruments | Software to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers) | |
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX) | National Instruments | Software to configure DAQ system settings | |
NI-DAQmx drivers | National Instruments | Driver for interacing with DAQ system | |
Nikon Eclipse Ni-E microscope | Nikon Instruments | ||
Osmium tetroxide 2% | Electron Microscopy Sciences | 19152 | |
Paraformaldehyde 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | PFA diluted down to 4% |
Paraphenylenediamine | Sigma Aldrich | P6001 | |
PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | PBS diluted down to 1x |
Propylene oxide | Electron Microscopy Sciences | 20401 | |
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated Tank | Ninja Paintball | Pressurized air tank | |
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mL | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mL | Fisher Scientific | 06-414-1C | |
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mL | Fisher Scientific | 06-414-1B | |
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab32376 | Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration |
Resin 812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi | Honeywell | 060-0708-10TJG | Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements |
Sucrose | Sigma Aldrich | S5016 | |
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi | Honeywell | Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements | |
Syringe/Needle Combo | Covetrus | 60728 | Syringe/Needle to perform IP injections |
Tissue-Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Freezing medium |
Toluidine blue | Fisher Scientific | BP107-10 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
UniSlide XY Table | Velmex | AXY40 Series | XY positioning table |
University Brush – Series 233- Round, Size 000 | Winsor and Newton | Paintbrush | |
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | Scissors for whole eye enucleation |
Virtual Instrument | National Instruments | Digital tool for data acquisition software |