نموذج جراحي لأنابيب الظهارة البولية أحادية المرحلة المهندسة في الخنازير الصغيرة
Summary
نادرا ما تتقدم الغرسات المهندسة بالأنسجة للجراحة الترميمية إلى ما بعد التجارب قبل السريرية بسبب الزراعة الشاقة خارج الجسم الحي ، والتي تتضمن مكونات سقالة معقدة ومكلفة. هنا ، نقدم إجراء أحادي المرحلة مصمم لتحويل البول مع سقالة أنبوبية قائمة على الكولاجين يمكن الوصول إليها تحتوي على ترقيع دقيق ذاتي.
Abstract
غالبا ما تواجه العمليات الجراحية الترميمية تحديا بسبب نقص أنسجة التطعيم. في علاج تشوهات الجهاز البولي التناسلي ، كان الحل التقليدي هو حصاد الأنسجة المعدية المعوية لإعادة البناء غير التقويمية بسبب وفرتها لإعادة تأسيس الوظيفة الطبيعية في المريض. غالبا ما ترتبط النتائج السريرية بعد إعادة ترتيب الأنسجة الأصلية داخل الجسم بمراضة كبيرة. وبالتالي ، فإن هندسة الأنسجة تحمل إمكانات محددة في هذا المجال من الجراحة. على الرغم من التقدم الكبير ، لم يتم بعد إنشاء السقالات المهندسة بالأنسجة كبديل علاجي جراحي صالح ، ويرجع ذلك أساسا إلى المتطلبات المكلفة والمعقدة للمواد والإنتاج والزرع. في هذا البروتوكول ، نقدم سقالة أنبوبية بسيطة ويمكن الوصول إليها قائمة على الكولاجين مدمجة مع جزيئات الأنسجة الذاتية الخاصة بالأعضاء ، والمصممة كقناة لتحويل البول. يتم بناء السقالة أثناء العملية الجراحية الأولية ، وتضم مواد جراحية متاحة بشكل شائع ، وتتطلب مهارات جراحية تقليدية. ثانيا ، يصف البروتوكول نموذجا حيوانيا مصمما لتقييم النتائج قصيرة المدى في الجسم الحي بعد الزرع ، مع إمكانية حدوث اختلافات إضافية في الإجراء. يهدف هذا المنشور إلى توضيح الإجراء خطوة بخطوة ، مع إيلاء اهتمام خاص لاستخدام الأنسجة الذاتية والشكل الأنبوبي.
Introduction
في تشوهات الجهاز البولي التناسلي ، يمكن أن تكون هناك حاجة لعملية جراحية ترميمية لاستعادة التشريح الوظيفي ، غالبا على مؤشر حيوي 1,2. استخدمت الأساليب الجراحية التقليدية الأنسجة الأصلية من أنظمة الأعضاء الأخرى (مثل الجهاز الهضمي) لإعادة بناء الأعضاء المشوهة أو المفقودة. ومع ذلك ، في كثير من الأحيان مع خطر حدوث مضاعفات شديدة بعد العملية الجراحية 3,4. في حالة تحويل البول للمرضى الذين يعانون من خلل وظيفي في المثانة العصبية ويحتاجون إلى قسطرة طويلة الأمد ، غالبا ما يتم استخدام الزائدة الدودية أو أجزاء الأمعاء الدقيقة المعاد تصميمها لبناء قناة بولية 5,6. تقدم هندسة الأنسجة أنسجة تطعيم بديلة يمكن تخصيصها لتلبية الخصائص الخاصة بالأعضاء ، وبالتالي تقليل المراضة بعد الجراحة للمرضى 7,8. في حين يمكن زرع السقالات من أنواع مختلفة من تلقاء نفسها ، فقد ثبت أن السقالة الخلوية الإضافية ، ويفضل أن تكون مع الخلايا الذاتية ، تعمل على تحسين نتائج التجدد بعد الزرع9،10،11،12،13،14. ومع ذلك ، غالبا ما تتكون السقالات المهندسة بالأنسجة من مكونات معقدة ومكلفة ، وثانيا ، متطلبات زراعة الخلايا خارج الجسم الحي وبذر السقالات شاقة وكثيفة الموارد. وقد أعاقت هذه العوامل الترجمة السريرية للسقالات المهندسة بالأنسجة على الرغم من عدة عقود من البحث في هذا المجال. من خلال تقليل التعقيد وكذلك المتطلبات النقدية والمادية ، يمكن تنفيذ السقالات المهندسة بالأنسجة في الجراحة الحديثة على نطاق واسع ، ومعالجة كل من الإجراءات النادرة والأكثر شيوعا.
تم إنشاء الكولاجين سابقا كمنصة قابلة للتطبيق لتوسيع الخلايا ، علاوة على ذلك ، يعمل كمادة لاصقة حيوية مواتية عند ربط الخلايا أو الأنسجة على سقالة للزرع الجراحي15،16،17. يتحايل التطعيم المجهري الذاتي في الفترة المحيطة بالجراحة على الحاجة إلى زراعة الخلايا خارج الجسم الحي عن طريق حصاد الأنسجة ذات الأهمية أثناء الإجراء الأولي وإعادة زرعها مباشرة. عن طريق فرم الأنسجة المقطوعة إلى جزيئات أصغر ، تزداد مساحة السطح وإمكانات النمو ، مما يسمح بنسبة تمدد أكبر على السقالة18. لا تلتصق السقالة القائمة على الكولاجين على وجه التحديد بإعادة بناء الجهاز البولي التناسلي ولكن يمكن تطبيقها نظريا على مناطق متعددة من إعادة بناء الأعضاء المجوفة.
في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا لبناء سقالة أنبوبية ، تجمع بين الكولاجين والطعوم الدقيقة للظهارة البولية الذاتية المدمجة ، ونموذج صغير يقيم الجدوى الفنية والسلامة ، بالإضافة إلى الأداء التجديدي ، للسقالة في الجسم الحي. تم تقييم النموذج في 10 إناث صغيرة كاملة النمو باستخدام البروتوكول والطريقة المعروضة هنا. الميزة الرئيسية للسقالة هي بساطة البناء والزرع أحادي المرحلة ، مما يجنب المريض العديد من العمليات الجراحية اللاحقة. يمكن إجراء العملية في الإعدادات الجراحية التقليدية من قبل طاقم جراحي منتظم وتتطلب معدات ومواد قياسية. يسمح النموذج الحيواني ببيئة خاضعة للرقابة لدراسة الزرع بينما يعود بسهولة إلى السلوك الطبيعي ، مع إمكانية إضافية لتنفيذ اختلافات في السقالة والإجراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم هذا البروتوكول تقنية بسيطة وسهلة للجراحات الترميمية المستقبلية. العيب الشائع في هندسة الأنسجة ، بما في ذلك توسع الخلايا الذاتية ، هو الخطوات التحضيرية المكلفة والكبيرة المطلوبة قبل الزرع الجراحي. قد يبسط التطعيم الدقيق الذاتي العديد من هذه الخطوات ويحتمل أن يسمح بإجراءات أحادية المرحلة. من خلال الزرع الذاتي للكيانات النسيجية المعقدة ، يتم تحفيز إشارات paracrine المؤيدة للتجدد18. في الدراسات السابقة ، اختبرنا أن الطعوم الدقيقة وحدها معرضة للبيئات المادية ما لم يتم ربطها بشكل مناسب بسقالة 15,19. تمت دراسة الكولاجين كبيئة قابلة للحياة لتوسيع الأنسجة في المختبر وتم اختياره لغرضنا بسبب توافقه الحيوي المناسب وتوافره التجاري. تم تحسين السقالة المركبة المعروضة هنا سابقا أثناء التجارب المختبرية لتقييم الاختلافات في تضمين الكسب غير المشروع الدقيق وتركيزات الكولاجين20،21،22. قبل الاختبار في الجسم الحي ، تم تقييم خصائص السقالة فيما يتعلق بالنفاذية والميكانيكا الحيوية والتدهور في المختبر20. علاوة على ذلك ، تم التحقق من صحة تمدد الأنسجة القائمة على السقالة في الجسم الحي سابقا في نماذج القوارضوالأرانب 21,22.
تم اختيار النموذج الجراحي لتقييم نسخة أنبوبية من السقالة ، تحاكي الإعداد السريري لتحويل البول لضعف المثانة العصبية في المرضى الأطفال أو المراهقين. تشمل الخطوات الحاسمة التشريح الدقيق للطعوم المخاطية الدقيقة والحفاظ على بيئة رطبة من وقت الاستئصال إلى تضمين السقالة. خطوة حاسمة أخرى تشمل التصلب هيدروجيل المناسب. يضمن السحب الدقيق للكولاجين عدم تشكل فقاعات الهواء داخل الجل ، وتضمن إعدادات درجة الحرارة الصحيحة وحلول المكونات تصلب الجل بشكل صحيح. سيؤدي الفشل في الحصول على هلام صلب إلى زيادة خطر تفريغ الكولاجين وانفصال الطعم الدقيق. بالنسبة للجزء الجراحي ، يعد التعامل الدقيق أثناء الزرع أمرا بالغ الأهمية لتجنب إتلاف الطعوم الدقيقة بسبب الصدمات الميكانيكية أو التفكك. قبل إغلاق البطن ، يجب معالجة سالكية السوائل بعناية عن طريق نفخ المثانة بالسوائل.
تشمل القيود المفروضة على هذه التقنية سمك السقالة ، والتي لها حدود عليا بشكل حدسي فيما يتعلق بنشر العناصر الغذائية من البيئة الخارجية إلى الطعوم الدقيقة. من ناحية أخرى ، قد يؤدي انخفاض سمك السقالة إلى نفاذية عالية بشكل غير مناسب وتسرب البول. يعتمد تكويننا الحالي على التقييمات السابقة في المختبر ، حيث تمت مقارنة تجديد الخلايا بتركيزات مختلفة من الكولاجين20. يعتمد التطعيم الدقيق للأنسجة الذاتية أيضا على أنسجة الكسب غير المشروع السليمة ، مما يجعل الإجراء الحالي غير مناسب للأمراض الخبيثة حيث لا يمكن استبعاد خطر إعادة الزرع السرطاني بشكل صحيح23 ؛ ومع ذلك ، تم تصميم التقنية الحالية للحالات التي تعاني من إعاقات إفراغ وظيفية حيث لا يعتبر ذلك خطرا. على الرغم من أن النموذج يحاكي عدة خطوات من الإعداد السريري (أي إجراء فغر الزائدة الدودية) ، إلا أن هذه التجربة لا تستخدم فغرة تعمل بكامل طاقتها لتحويل البول لأن القناة مربوطة بعيدا. أيضا ، نظرا لأن المضاعفات السريرية يمكن أن تحدث مدى الحياة ، فقد توفر فترة المراقبة لمدة 6 أسابيع معرفة محدودة بنتائج محددة بشأن القيود والاستمرارية. لذلك ، يمكن إضافة متابعة إضافية لمدة 6 أشهر إلى الدراسة بعد مفاغرة القناة الملتئمة إلى مستوى الجلد.
يتعلق منظور هذه التقنية بالتصميم البسيط ، مما يتيح التطبيقات العالمية في حالة استبدال أصل أنسجة الكسب غير المشروع الدقيق والمواد الحيوية الداعمة ببدائل أخرى ذات صلة. يمكن تعديل هذه المكونات لتناسب الأغراض الخاصة بالأعضاء المتعلقة بقوة السقالة ومرونتها والتحلل البيولوجي. وأخيرا، تسمح النفقات التي يمكن الوصول إليها والمنخفضة التكلفة بإمكانية استنساخ التقنية وترجمتها موسعة.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الموظفين في قسم الطب التجريبي (AEM) ، جامعة كوبنهاغن ، للمساعدة في تخطيط وتنفيذ جراحات وتربيتها ، و ELLA-CS ، s.r.o ، Hradec Kralove ، جمهورية التشيك ، لتوفير دعامات قابلة للتحلل مخصصة تستخدم في الدراسة. تم تقديم الدعم المالي من قبل الجمعية السويدية للبحوث الطبية ، ومؤسسة Promobilia ، ومؤسسة Rydbeck ، ومؤسسة Samariten ، ومؤسسة الرعاية الصحية للأطفال ، ومؤسسة Frimurare Barnhuset في ستوكهولم ، ومؤسسة Novo Nordisk (NNFSA170030576).
Materials
| 10x MEM | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US | 2517592 | Collagen preparation |
| 1x MEM | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US | 2508924 | Collagen preparation |
| Ambu aScope 4 Cysto | Ambu A/S, Ballerup, DK | 1000682507 | Cystoscope |
| Aquaflush ACE stopper | Abena, Taastrup, DK | ACE12/220501 | ACE stopper |
| Borgal vet inj opl 200 + 40 mg/mL | Ceva Animal Health A/S | 510460 | Sulfonamide/Trimethoprim |
| Bupaq multidose vet 0.3 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 502763 | Buprenorphin |
| Butomidor vet inj 10 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 531943 | Buthorphanol |
| Comfortan vet inj 10 mg/mL | Dechra Veterinary Products A/S, DK | 492312 | Metadone |
| Ethilon suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SGBCXV | Monofilament non-resorbable |
| Fentanyl inj 50 µg/mL(hamel) | Hameln Pharma ApS, DK | 432520 | Fentanyl |
| Ketador vet inj 100 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 115727 | Ketamine |
| Metacam inj 20 mg/mL t.cattle/pig/horse | Boehringer Ingelheim Animal, DE | 6443 | Meloxcicam |
| Metacam oral suspension 15 mg/mL pigs | Boehringer Ingelheim Animal, DE | 482780 | Meloxcicam |
| Omnipaque | GF Healthcare, Oslo, NO | 16173849 | Contrast for CT |
| Pancytokeratin CK-AE | DAKO Agilent, US | GA053 | Clone AE1/AE3 |
| PDS suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SEMMTQ | Monofilament slow-resorbable |
| Prolene suture 4-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | PGH187 | Monofilament non-resorbable |
| Propolipid t.inj/inf 10 mg/mL | Fresenius Kabi, DK | 21636 | Propofol |
| Rat-tail collagen type I | First Link Ltd, Wolverhampton, UK | 60-30-810 | 2.06 mg/mL protein in 0.6% acetic acid |
| Suprim vet 20 + 100 mg (Solution for use in drinking water) | Dechra Veterinary Products A/S, DK | 33661 | Sulfonamide/Trimethoprim |
| SX-ELLA Degradable Biliary DV stent | ELLA-CS, Trebes, CZ | S23000056-01 | ø 6 mm x 60 mm |
| Vicryl mesh | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | VM1208 | Mesh |
| Vicryl suture 4-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SMBDGDR0 | Braided fast-resorbable |
| Xysol vet inj 20 mg/mL | ScanVet Animal Health A/S, DK | 54899 | Xylazine |
| Zoletil 50 vet plv/sol t.inj 25 + 25 mg/mL | Virbac Danmark A/S, DK | 568527 | Tiletamine and Zolazepam |
References
- Surer, I., Ferrer, F. A., Baker, L. A., Gearhart, J. P. Continent urinary diversion and the exstrophy-epispadias complex. J Urol. 169 (3), 1102-1105 (2003).
- Cranidis, A., Nestoridis, G. Bladder augmentation. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 11 (1), 33-40 (2000).
- Atala, A., Bauer, S. B., Hendren, W. H., Retik, A. B. The effect of gastric augmentation on bladder function. J Urol. 149 (5), 1099-1102 (1993).
- Husmann, D. A. Mortality following augmentation cystoplasty: A transitional urologist’s viewpoint. J Pediatr Urol. 13 (4), 358-364 (2017).
- Mitrofanoff, P. Trans-appendicular continent cystostomy in the management of the neurogenic bladder. Chir Pediatr. 21 (4), 297-305 (1980).
- Leslie, B., Lorenzo, A. J., Moore, K., Farhat, W. A., Bägli, D. J., Pippi Salle, J. L. Long-term followup and time to event outcome analysis of continent catheterizable channels. J Urol. 185 (6), 2298-2302 (2011).
- Horst, M., Eberli, D., Gobet, R., Salemi, S. Tissue engineering in pediatric bladder reconstruction-The road to success. Front Pediatr. 7, 91 (2019).
- Ajalloueian, F., Lemon, G., Hilborn, J., Chronakis, I. S., Fossum, M. Bladder biomechanics and the use of scaffolds for regenerative medicine in the urinary bladder. Nat Rev Uro. 15 (3), 155-174 (2018).
- Dorin, R. P., Pohl, H. G., De Filippo, R. E., Yoo, J. J., Atala, A. Tubularized urethral replacement with unseeded matrices: what is the maximum distance for normal tissue regeneration. World J Uro. 26 (4), 323-326 (2008).
- El Kassaby, A. W., AbouShwareb, T., Atala, A. Randomized comparative study between buccal mucosal and acellular bladder matrix grafts in complex anterior urethral strictures. J Urol. 179 (4), 1432-1436 (2008).
- Casarin, M., et al. Porcine small intestinal submucosa (SIS) as a suitable scaffold for the creation of a tissue-engineered urinary conduit: Decellularization, biomechanical and biocompatibility characterization using new approaches. Int J Mol Sci. 23 (5), 2826 (2022).
- Casarin, M., et al. A novel hybrid membrane for urinary conduit substitutes based on small intestinal submucosa coupled with two synthetic polymers. J Funct Biomater. 13 (4), 222 (2022).
- Drewa, T. The artificial conduit for urinary diversion in rats: a preliminary study. Transplant Proc. 39 (5), 1647-1651 (2007).
- Liao, W., et al. Tissue-engineered tubular graft for urinary diversion after radical cystectomy in rabbits. J Surg Res. 182 (2), 185-191 (2013).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. Biomed Res Int. 2013, 212734 (2013).
- Ajalloueian, F., Nikogeorgos, N., Ajalloueian, A., Fossum, M., Lee, S., Chronakis, I. S. Compressed collagen constructs with optimized mechanical properties and cell interactions for tissue engineering applications. Int J Biol Macromol. 108, 158-166 (2018).
- Chamorro, C. I., Zeiai, S., Engberg, G. R., Fossum, M. Minced tissue in compressed collagen: A cell-containing biotransplant for single-staged reconstructive repair. J Vis Exp. 108, 53061 (2016).
- Juul, N., et al. Insights into cellular behavior and micromolecular communication in urothelial micrografts. Sci Rep. 13 (1), 13589 (2023).
- Reinfeldt Engberg, G., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. Expansion of submucosal bladder wall tissue in vitro and in vivo. Biomed Res Int. 2016, 5415012 (2016).
- Juul, N., Ajalloueian, F., Willacy, O., Chamorro, C. I., Fossum, M. Advancing autologous urothelial micrografting and composite tubular grafts for future single-staged urogenital reconstructions. Sci Rep. 13 (1), 15584 (2023).
- Willacy, O., Juul, N., Taouzlak, L., Chamorro, C. I., Ajallouiean, F., Fossum, M. A perioperative layered autologous tissue expansion graft for hollow organ repair. Heliyon. 10 (3), e25275 (2024).
- Chamorro, C. I., et al. Exploring the concept of in vivo guided tissue engineering by a single-stage surgical procedure in a rodent model. Int J Mol Sci. 23 (20), 12703 (2022).
- Casarin, M., Morlacco, A., Dal Moro, F. Bladder substitution: The role of tissue engineering and biomaterials. Process. 9 (9), 1643 (2021).
.