Summary

Une approche pour la construction de communautés de biofilms multispécifiques à partir du sol de la rhizosphère

Published: May 24, 2024
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Summary

Une procédure rapide et standardisée pour établir des communautés de biofilms multi-espèces synergiques à partir de divers sols de la rhizosphère est présentée ici. Il s’agit d’un protocole unique conçu pour sonder et simuler le microbiote complexe du sol de la rhizosphère.

Abstract

Le biofilm multi-espèces est un mode de vie naturel et dominant des bactéries dans la nature, y compris dans le sol de la rhizosphère, bien que la compréhension actuelle soit limitée. Ici, nous proposons une approche pour établir rapidement des communautés synergiques de biofilms multi-espèces. La première étape consiste à extraire des cellules du sol de la rhizosphère en utilisant la méthode de centrifugation différentielle. Ensuite, ces cellules du sol sont inoculées dans le milieu de culture pour former un biofilm pelliculaire. Après 36 h d’incubation, la composition bactérienne du biofilm et de la solution sous-jacente est déterminée à l’aide de la méthode de séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S. Pendant ce temps, l’isolement bactérien à haut débit du biofilm pellicle est effectué à l’aide de la méthode de dilution limitante. Ensuite, les 5 premiers taxons bactériens sont sélectionnés avec la plus grande abondance dans les données de séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S (échantillons de biofilm de pellicule) pour une utilisation ultérieure dans la construction de communautés de biofilms multi-espèces. Toutes les combinaisons des 5 taxons bactériens ont été rapidement établies à l’aide d’une plaque de 24 puits, sélectionnée pour la plus forte capacité de formation de biofilm par le test de coloration au violet cristallin, et quantifiée par qPCR. Enfin, les communautés de biofilms multi-espèces bactériennes synthétiques les plus robustes ont été obtenues par les méthodes ci-dessus. Cette méthodologie fournit des orientations informatives pour mener des recherches sur le biofilm multi-espèces de la rhizosphère et identifier des communautés représentatives pour étudier les principes régissant les interactions entre ces espèces.

Introduction

Les biofilms représentent des communautés microbiennes complexes, soit fixées à des surfaces, soit reliées par des interfaces. Il est largement reconnu que la majorité des bactéries rencontrées dans divers environnements, tels que les habitats naturels, les milieux cliniques et les contextes industriels, perdurent au sein des communautés de biofilms1. Dans le sol, la rhizosphère, qui englobe la surface racinaire et la région adjacente de 2 mm d’épaisseur, forme une niche écologique avec une disponibilité accrue des nutriments. Des bactéries spécifiques ont développé des stratégies pour exploiter ce créneau, favorisant la prolifération microbienne et favorisant la formation de communautés de biofilms dans la rhizosphère2.

Les microbes de la rhizosphère sont considérés comme le « deuxième génome » des plantes3. Les micro-organismes favorisant la croissance des plantes (PGPM) s’engagent dans une symbiose mutualiste avec les plantes, fournissant des fonctions significatives de promotion de la croissance et de biocontrôle4. D’une part, le PGPM peut fournir des nutriments aux racines des plantes, améliorer l’absorption des nutriments, se défendre contre les agents pathogènes et dégrader les polluants dans le sol de la rhizosphère5. D’autre part, le PGPM utilise les exsudats racinaires des plantes comme source de nutriments pour la croissance et l’évolution, influençant ainsi le sol de la rhizosphère et le système racinaire par leur propre métabolisme. Il convient de noter que la condition préalable à toutes ces fonctions est la colonisation efficace des PGPM dans la rhizosphère végétale, formant des biofilms stables6.

Le biofilm de la rhizosphère affecte le processus d’assemblage des microbes de la rhizosphère, et les caractéristiques temporelles et spatiales de l’assemblage des microbes de la rhizosphère sont étroitement liées à l’interaction du biofilm multi-espèces7. Il sert de plaque tournante des interactions plante-microbiome, fournissant une niche stable et contrôlable pour qu’ils interagissent efficacement. Par conséquent, l’étude du biofilm de la rhizosphère est également une direction importante pour mieux comprendre l’interaction entre les plantes et les microbes.

Cependant, il existe actuellement peu de recherches sur les biofilms multi-espèces de la rhizosphère. La grande complexité de la composition du microbiome rend difficile la réponse aux questions écologiques fondamentales entourant les communautés microbiennes naturelles8. Au cours des expériences, de nombreuses conditions, telles que le type de sol, le type de plante et le grand nombre de communautés microbiennes, doivent être prises en compte. Divers facteurs limitent la recherche de biofilms multi-espèces de la rhizosphère.

Pour étudier plus en détail les communautés de biofilms multispécifiques du sol de la rhizosphère, telles que les interactions synergiques interespèces ou l’alimentation croisée des métabolites8, il est souhaitable de construire artificiellement une communauté microbienne synthétique simplifiée, représentative, stable et traitable dans des conditions de laboratoire 9,10. Ici, un protocole standardisé combine plusieurs des dernières techniques microbiologiques et bioinformatiques.

Protocol

Ce protocole est généralement applicable au microbiote du sol de la rhizosphère de diverses plantes. Ici, le concombre est utilisé comme exemple. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux. 1. Isolement bactérien Isolement du sol de la rhizosphèreCulture du concombreDésinfectez les graines de concombre avec une solution d’éthanol à 75 % et d’hyp…

Representative Results

Suite à la procédure mentionnée, des gradients significatifs de la capacité de formation de biofilms à partir du microbiote du sol de la rhizosphère du concombre sont observés (Figure 1). Le séquençage de l’amplicon du biofilm a confirmé la présence de l’espèce dans la pellicule (Figure 2). D’après la cartographie thermique des données de séquençage, les cinq principales espèces bactériennes dont l’abondance dans la pellicule est supér…

Discussion

Conformément au protocole, une série de communautés de biofilms synthétiques multi-espèces robustes sont construites sur la base du microbiote dans le sol de la rhizosphère à partir de différentes plantes. À l’aide de techniques de PCR quantitative, la composition de chaque communauté est clairement déchiffrée. La biomasse du biofilm indique la force de leurs interactions métaboliques potentielles, bien que diverses propriétés et mécanismes à l’origine de la coopération n’aient pas pu être révé…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (42307173 et 42107328) et le Programme national de recherche et de développement clés (2022YFD1500202 et 2022YFF1001800). P.W, Z.X ont conçu l’étude. P.W, B.X, Z.C, J.X et N.Z ont analysé les données et créé les chiffres. P.W a écrit la première ébauche du manuscrit. Z.X., R.Z. et Q.S. révisèrent le manuscrit.

Materials

0.2 % Na4P2O7 solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 20041418 Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. F613463-0001 Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. L03336903 Used to sterilize the seeds.
24-well Plate Merck & Co., Inc. PSRP010 Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) Bioolook Scientific Research Special 2360010 Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. 62.547.254 Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 801769680 Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd. D3350020000K04U021 Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I Nanjing Agricultural University N/A Black soil from Jilin Province.
Black Soil II Nanjing Agricultural University N/A Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10035048 Used to prepare MSgg media.
Centrifuge Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. G508009-0001 High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix Vazyme Biotech Co.,Ltd. Q311-02 Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. NB026143 Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd GNP-9080BS-Equation 1 Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. A600331 Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed Nanjing Agricultural University N/A "Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0 The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences N/A Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10011918 Used to prepare MSgg media.
Fridge Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd. BCD-556WKPM(Q) Used for strain preservation.
Glutamate Bioolook Scientific Research Special 2180020 Used to prepare MSgg media.
Glycerol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010618 Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket Yulv Furniture Store 6526262626 Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10017618 Used to prepare MSgg media.
MgCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 7791186 Used to prepare MSgg media.
MnCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10400101 Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd. BES20791KB Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O Merck & Co., Inc. S9390-100G Used to prepare TSB media.
NaCI Chinasun Specialty Products co., Ltd. HS0416 Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O Merck & Co., Inc. S9638-25G Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. E607008-0001 Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine RYON RT3486L005 Used to prepare MSgg media.
Pipette Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. BS-1000-T Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd. D102A Used to generate qPCR standard curves.
Pot Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. YHHWS2401 Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. N/A Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd. 4484073 Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary The Wellcome Trust SangerInstitute N/A Used to design primers of qPCR
Shaker Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd ZQTY-50S Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77 Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd. SL77080596 Used to prepare TSB media.
Soy peptone Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd HB8275 Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd. 76713100010 Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. SW150302 Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. 223016852LLZA Used for basic experimental operations.
Template DNA Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. N/A Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine Bioolook Scientific Research Special 2180020 Used to prepare MSgg media.
Tryptone Thermo Fisher Scientific LP0042B Used to prepare TSB media.
Tryptophan Bioolook Scientific Research Special 2190020 Used to prepare MSgg media.
TSB Medium Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd. 024048 Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium Nanjing Agricultural University N/A Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2 Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd C0310520123 Used to prepare MSgg media.

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Citer Cet Article
Wang, P., Xia, B., Chen, Z., Xie, J., Sun, X., Tian, Q., Gao, C., Xun, W., Zhang, N., Zhang, R., Shen, Q., Xu, Z. An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil. J. Vis. Exp. (207), e66926, doi:10.3791/66926 (2024).

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